De acuerdo con lo recomendado por Ekwall et al.[14], la morfología celular es un análisis que debe hacerse antes y después del test de toxicidad de manera tal de poder comparar la apariencia de las células con los resultados de estos ensayos. Dado que los nanomateriales en estudio (A, B y C) se organizan en superestructuras que exhiben diferentes aspectos superficiales, y que el objetivo de este ensayo fue evaluar el efecto de las nanopartículas sobre el comportamiento celular, los materiales fueron vigorosamente sonicados para dispersar las partículas en el medio de cultivo.
La figura 7.6 muestra la apariencia del cultivo celular en el momento inicial, tiempo en el que el material y las células son incorporados simultáneamente; y luego de 24 horas de co-incubación. La condición control corresponde a células cultivadas en ausencia de materiales.
En el tiempo inicial se observa células de aspecto redondeado, ya que éstas aún no comenzaron a adherirse; el material, en todos los casos, se observa homogéneamente distribuido en el área de cultivo, a excepción de algunos agregados que son más evidentes en los materiales B y C.
Al cabo de 24 horas, es posible observar una fuerte interacción entre los materiales A y B con los fibroblastos; sin embargo, esta asociación no parece tener impacto sobre el comportamiento celular en lo que respecta a morfología y adhesión. La interacción con el material C, por otra parte sí parece afectar el normal funcionamiento de estas células. En este caso, tras 24 horas de incubación, la mayoría de los fibroblastos muestran una tendencia hacia la retracción de sus protrusiones, se vuelven redondeados y pierden capacidad de adherencia, aglomerándose en torno a las partículas.
Para poder tener una visión más detallada de la interacción que existe entre los materiales y este modelo celular, se decidió evaluar la morfología de un cultivo de fibroblastos luego de 24 horas de incubación, en presencia de A, B y C, empleando microscopía óptica de contraste de fases, figura 7.7. Nuevamente, células sin tratar fueron utilizadas como control negativo (C–) para contrastar resultados.
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Figura 7.6: Células L929 cultivadas en presencia (tratamiento) y ausencia (control) de los materiales A (TiO2), B (Ce-TiO2) y C (CeO2-TiO2) suspendido en el medio de cultivo. Las fotografías de microscopía
óptica fueron tomadas in situ, en campo claro, sobre la placa de cultivo al inicio del tratamiento (t= 0 h) y al final del mismo (t= 24 h). Se observa una fuerte asociación entre las partículas y las células al final del tratamiento pero no es posible determinar la localización celular de las mismas.
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Figura 7.7: Microscopía óptica de contraste de fases mostrando la morfología celular de los fibroblastos de ratón luego de 24 horas de cultivo en presencia de los materiales TiO2 (A), Ce-TiO2 (B)
Y CeO2-TiO2 (C). Células cultivadas en ausencia de materiales fueron utilizadas como control negativo
(C-). Magnificación 40X.
La figura 7.7 muestra que las células control crecen y se esparcen normalmente sobre el sustrato, mostrando muchos de los caracteres propios de fibroblastos normales: presentan un citoplasma irregular, ramificado y en forma de huso, con gran cantidad de protrusiones filopódicas. Una morfología similar se observa cuando las células son tratadas con los materiales A y B, en forma consistente con las observaciones realizadas en el cultivo sin fijar (figura 7.7). En el cultivo de los fibroblastos en presencia del material C, sin embargo, puede observarse que aquellas células rodeadas por gran cantidad de partículas adquieren un aspecto redondeado, mostrando evidencia clara de una reducción de las protrusiones pseudopodiales (flechas amarillas en la figura 7.7). Además, estas células pierden capacidad de adherirse al sustrato, forman agregados (círculos de puntos en la figura 7.8) y pueden ser fácilmente desprendidas de su soporte cuando se las lava.
En todos los casos, la observación microscópica pone en evidencia la fuerte interacción que existe entre los materiales y las células; sin embargo, este análisis no permite determinar categóricamente la localización celular exactas de las partículas, aunque se sospecha que están
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alojadas en la superficie celular y/o fuertemente asociadas a la membrana plasmática (flechas rojas en figura 7.7).
La interacción de nanopartículas y la membrana celular es dependiente del tamaño de la nanopartícula y muy probablemente está íntimamente ligada al proceso de envoltura que inicia la endocitosis mediada por receptores; proceso cuya iniciación requiere la formación concertada de múltiples interacciones nanopartícula-receptor[15]. Varios modelos matemáticos han demostrado que la endocitosis mediada por receptor es óptima cuando no escasean puntos de unión tanto en las nanopartículas como en la superficie celular[16]. Termodinámicamente, una partícula de 50-60 nm es capaz de reclutar suficiente cantidad de receptores como para desencadenar exitosamente el proceso de internalización[17]. La absorción pasiva de las nanopartículas también depende del tamaño, y ésta es frecuente cuando no superan los 15-20 nm de diámetro, aunque esta característica depende del modelo celular empleado y de las propiedades fisicoquímicas de la partícula[15]. Aunque es necesario profundizar más sobre la interacción entre estos materiales y el modelo celular elegido para poder ser verdaderamente concluyentes al respecto, es posible conjeturar en principio que, como el tamaño de partícula de los materiales A, B y C oscila entre 28 y 40 nm, la sospecha de que las partículas no se encuentran internalizadas sería consistente con lo reportado en la literatura por otros autores.
Figura 7.8: Microfotografías ópticas de contraste de fases mostrando agregados celulares (círculos en línea de puntos) luego de 24 horas de cultivo en presencia del material C (CeO2-TiO2).
Magnificación 40X.
El evidente efecto del material C sobre la adhesión superficial de los fibroblastos puede entenderse a partir de las características de hidrofobicidad del material, ya que éste se distingue por poseer la mayor intensidad en las bandas del espectro de infrarrojo cercano (sección 4.3.1.5, capítulo 4) que denotan su mayor capacidad para captar moléculas de agua y lo que lo convierte en el material más hidrofílico. Para lograr una correcta adhesión celular, debe existir una superficie
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moderadamente hidrofílica, que resulta óptima ya que, superficies extremadamente hidrofílicas, tales como las de diamantes nanoestructurados (ángulo de contacto de aproximadamente 2°) [18] o altamente hidrofóbicas, tales como copolímeros en bloque de ácido poli DL-láctico y polioxietileno [19], resisten casi totalmente la adhesión celular. Superficies altamente hidrofílicas, entonces, como es el caso del material C, limitan o impiden totalmente la adhesión y el crecimiento celular. Se sabe que este tipo de superficies se adsorben débilmente a las moléculas de la membrana celular encargadas de la adhesión, lo cual puede dar lugar al desprendimiento de las células de su sustrato, especialmente en períodos de cultivo prolongados, cuando son capaces de unir varias células simultáneamente[20].
Un factor que merece ser considerado a la hora de evaluar la toxicidad del material C es la incorporación de estructuras de cerio en la matriz de TiO2. Como se explicó en el capítulo 2, el
material C es sintetizado utilizando nanopartículas de CeO2 como fuente de cerio, mientras que los
materiales B y B1-B8 son preparados a partir de concentraciones crecientes de tripentanoato de cerio
que están por encima y por debajo de la concentración de Ce empleada en la síntesis del material C. Para indagar si el efecto negativo observado en la actividad metabólica y la adhesión celular pueden ser atribuidos a la presencia del lantánido, se decidió evaluar los mismos parámetros en la serie B1-
B8 para contrastar resultados. Su discusión se encuentra desarrollada en la sección siguiente.