Performance/confidentiality tradeoffs

La posibilidad de recombinación homóloga (gene targeting) en células somáticas previo a la transferencia nuclear ha captado la atención de las principales compañías biotecnológicas. La modificación genética que conduce a la pérdida de función de un gen, o más comúnmente conocida como gene knock out, ha sido utilizada extensivamente en el ratón para obtener un mayor entendimiento de la función génica y como modelo para ciertas enfermedades (Shastry, 1998; Kolb y col., 1999; Wallace y col., 2000).

11.1. Generación de ratones knockouts

Los ratones knockout están alterados genéticamente de tal manera que un gen concreto (diana) se ha interrumpido (inactivado y se ha convertido en no funcional. Es una técnica compleja que utiliza la combinación de ADN recombinante, de cultivos celulares y de manipulación de embriones. La técnica de construcción del un ratón knockout fue desarrollada en 1989 por varios grupos, como el de Mario Cappechi en la Universidad de UTA, el de Oliver Smithies en la Universidad de Carolina del Norte, y el de Elizabeth Robertson en la Harvard Medical School.

Al tercer día de post-fertilización de las hembras de ratón son obtenidas del útero las células ES, que derivan de la masa celular interna de la blástula en desarrollo.

Las células ES se cultivan en placas que contienen fibroblastos embrionarios incapaces de dividirse llamados feeder cells.

Fig.19. Superovulación de una hembra agouti, donadora de células ES, y obtención de cultivos de células ES a partir de los blastocistos aislados del útero de la hembra.

A continuación el constructo de ADN, que contiene un marcador (o dos) de selección, es transfectado de manera estable en las células ES mediante

electroporación o lipofección. En algunas de estas células ES el vector de ADN introducido habrá reemplazado al gen normal por un suceso de recombinación. Se realiza análisis de PCR o Southern blots para comprobar qué sub-líneas contienen el ADN incorporado a su genoma.

La recombinación homóloga en las células ES es el proceso de inserción génica que requiere de una recombinación homóloga entre secuencias del vector y secuencias genómicas. La inserción génica conduce a la interrupción del gen y a la incorporación de la región codificadora del marcador de selección, lo que permite realizar el seguimiento en las posteriores manipulaciones.

Fig.20. Esquema de recombinación del vector introducido en las células ES con el genoma, de manera que se introduce la región codificadora para el marcador de selección escogido en este caso, gen de resistencia a la neomicina.

Se seleccionan las células ES que contienen una copia del gen recombinante y un alelo normal, y se las hace crecer en cultivo. Estas células genéticamente modificadas se inyectan a un embrión de ratón, en el que participarán en la formación de los tejidos y órganos adultos. Se transfiere el embrión quimera a una madre adoptiva para que se complete su desarrollo. Se pueden utilizar genes del color del pelaje como marcadores para seleccionar posteriormente a los ratones quimera que tengan células germinales provenientes de las células ES genéticamente modificadas.

Los ratones heterocigotos pueden cruzarse para obtener ratones homocigotos para el gen inactivado. Estos ratones homocigotos se denominan knockout ya que se ha mutado o suprimido la funcionalidad de un gen.

Fig.21.Construcción de un ratón Knockout

La eficiencia del método es alta y la inserción en el genoma es dirigida.

La desventaja del método es que la frecuencia de recombinación es baja, del orden de 10-5_{. Los factores que afectan a la recombinación son:}

- El largo de la secuencia del vector

- El grado de homología entre las secuencias homólogas del vector y las secuencias blanco

- La ubicación cromosómica del gen blanco

Es posible aplicar esta técnica para producir animales con múltiples genes inactivados implicando a varios genes de una vía bioquímica, así como desarrollar animales que tienen genes inactivados en un determinado tejido, o que contienen genes discapacitados en lugar de inactivados.

11.2. Condicional knockouts

Esta técnica permite inactivar un gen sólo en tejidos particulares y/o a tiempos específicos durante su ciclo de vida. Un ejemplo es la mutagénesis condicional que lograron en el año 2006 en Max-Planck-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Alemania con el ratón NEX-Cre.

Crearon una línea de ratones que expresaba la recombinasa Cre bajo el control de las secuencias regulatorias de NEX, gen que codifica para la proteína neuronal bHLH. Para mimetizar la expresión endógena de NEX en el telencéfalo dorsal, la recombinasa Cre fue insertada en el locus de NEX por recombinación homóloga en células ES. El patrón de expresión de Cre fue analizado después de que las líneas se cruzaran con líneas de ratones que tenían insertado el gen marcador lac-Z. Se visualizó una expresión prominente

Fig.21. Sección frontal cerebral de un ratón doble transgénico NEX-Cre*LacZ- marcador a la edad de 55 días. La tinción de lac-Z corresponde exactamente a la expresión conocida de los dominios del gen NEX, como el hipocampo y el neocortex.

11.3. Aplicaciones de las técnicas knockout

Actualmente existe una gran carencia de órganos para trasplantes humanos que no es cubierta por las donaciones. El trasplante de órganos de animales hacia humanos (xenotrasplantes) podría ser la solución. Sin embargo, existen muchas barreras de rechazo entre especies que limitan su uso. La principal barrera consiste en el fenómeno de rechazo hiperagudo debido a la presencia de anticuerpos naturales contra epítopes del disacárido galactosa 1-3 galactosa presente en las superficies celulares de mamíferos, pero que estarían ausentes en las superficies celulares de humanos y monos (Gallili y col., 1985). Este es uno de los principales usos donde la tecnología de recombinación homóloga acoplada con transferencia nuclear está siendo explotada. La reciente generación de cerdos transgénicos en los que se eliminó el gen 1-3 galactosiltransferasa y que permitiría la producción de animales que carecen del epítope responsable del rechazo hiperagudo, es una clara demostración del poder de esta tecnología (Phelps y col., 2003).

Otra de las aplicaciones de esta tecnología está en la creación de animales resistentes a ciertas enfermedades. Las enfermedades ocasionadas por priones han tenido un enorme impacto económico en algunos países de Europa y la utilización de productos animales para su uso en humanos es una preocupación constante.

Este es el caso de la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) o más comúnmente conocida como enfermedad de las vacas locas que sería la causa de una nueva forma de enfermedad de Creuzfeldt Jacob en humanos denominada vCJD (Hill y col., 1997). Experimentos realizados en ratones (Prusiner y col., 1993) y más recientemente en ovejas (Denning y col., 2001), demuestran que es factible eliminar el gen para los priones (PrP) mediante recombinación homóloga y que los animales producidos son resistentes al Scrapie. Dado que las ovejas y vacas están siendo utilizadas para producir proteínas humanas de uso farmacológico y que estos animales poseen genes

funcionales PrP, sería apropiado producir poblaciones de animales resistentes a estos priones.

La tecnología de recombinación homóloga ha sido ampliamente utilizada en el ratón para producir varios modelos de enfermedades humanas. Sin embargo, debido a las diferencias fisiológicas sería más apropiado disponer de modelos animales que se asemejen más al humano. Este es el caso del modelo para fibrosis quística creado en el ratón, donde se eliminó el gen Cftr (Cystic fibrosis transmembrane responder). Este modelo no presentó las características típicas de la enfermedad en humanos debido a las diferencias en la fisiología del pulmón del ratón (Davidson y col., 1995). La eliminación del gen Cftr en la oveja se esperaría produjera un modelo animal para fibrosis quística más exacto debido a las similitudes de la fisiología pulmonar entre ovejas y humanos.

Las modificaciones en los animales que pudieran influir rasgos de producción tales como el crecimiento y la eficiencia de alimentación son uno de los principales objetivos en el mejoramiento animal. Ratones en donde el gen de la miostatina se eliminó mediante recombinación homóloga desarrollaron mayor musculatura esquelética que los controles no modificados (McPherron y col., 1997). Además, el fenotipo de doble musculatura de algunas razas bovinas, por ejemplo Belgian Blue, ha sido asociado a modificaciones (mutaciones naturales) del gen de la miostatina (Grobet y col., 1997). Por lo tanto, la eliminación de este gen en bovinos, ovejas y cerdos podría producir animales con mayor masa muscular, lo cual sería de enorme importancia económica. Tal es así que actualmente existe una empresa biotecnológica en USA (http:// www.prolinia.com) cuyo objetivo es proporcionar la clonación a los mejoradores de razas registradas, para luego mediante ingeniería genética proveer a estas razas elite de características deseables como la mutación para el gen de la miostatina.

Otra característica productiva que se podría mejorar a través de esta tecnología es la leche. La leche aporta cerca del 30% de las proteínas consumidas en los países desarrollados. Por esta razón, la lactancia ha sido objeto de diversos estudios en el campo de genética, fisiología y nutrición. La recombinación homóloga podría ser utilizada para reemplazar genes de las proteínas de la leche de los animales de granja con la respectiva contraparte de los genes humanos para utilizarlos como fuentes de proteínas. Por ejemplo, la seroalbúmina humana es utilizada ampliamente para el tratamiento de quemaduras y como reemplazo de fluidos corporales en cirugía. La escala de requerimiento de esta proteína (~ 600 toneladas al año) la hacen un muy buen candidato para su producción a escala comercial en la leche de vacas transgénicas. Desafortunadamente, la seroalbúmina bovina es muy similar a la humana, lo que genera problemas para su purificación. Una solución sería reemplazar el gen bovino con su contraparte humana, así la proteína bovina sería eliminada sin alterar o comprometer la viabilidad del animal. Otro ejemplo lo constituye la ß-Lactoglobulina que está presente sólo en la leche de rumiantes y no tiene una función conocida en el proceso de secreción de leche (Clark y col., 1998). Su presencia confiere algunas propiedades de elaboración indeseadas y se cree es la responsable de la mayoría de las alergias a la leche bovina, situación que afecta a una considerable parte de la población mundial. Por lo tanto, la eliminación de esta proteína podría proporcionar nuevas propiedades tecnológicas a la leche (Richardson, 1985). Además, su eliminación no sólo ayudaría con el problema de las alergias, sino que también, debido a la compensación compensación que se produciría en la concentración de las otras proteínas de la leche, probablemente incrementaría

quesera. De la misma forma, la sobreexpresión de caseínas en la leche se esperaría que alterara significativamente las propiedades tecnológicas de la misma como fuera demostrado recientemente por Brophy y col., (2003) y la expresión de proteasas podría generar resistencia a enfermedades de gran impacto en el sector lechero como la mastitis (Kerr y col., 2001).