El estado del arte en la clonación ha permitido su empleo en dos direcciones claramente definidas: La clonación con fines reproductivos y la clonación con fines terapéuticos. La primera apunta a duplicar seres vivos completos,
mientras que la segunda promete convertirse en una alternativa para prevenir y tratar ciertas enfermedades, así como para el reemplazo de tejidos y órganos lesionados.
Clonación terapéutica. Las células madre o troncales son células
pluripotenciales de gran tamaño que, después de experimentar un proceso de diferenciación, se especializan en una direcciónfuncional determinada, hacia una gran variedad de tipos celulares.
Las células madre se pueden obtener en dos formas diferentes:
1. A partir de células de la masa celular interna o del trofoectodermo de blastocistos clonados mediante la técnica de transferencia nuclear y cultivadas in vitro.
A las células somáticas donantes se las manipula para inducirlas a un proceso de diferenciación en tipos celulares determinados, que posteriormente se utilizarán en el tratamiento de ciertas enfermedades incurables. La ventaja de esta técnica radica en que las células madre embrionarias, una vez transplantadas, no provocan rechazo inmunológico, pues se comportan como injertos autólogos, gracias a que son genéticamente idénticas a las células del receptor o del paciente.
El problema de los transplantes heterólogos, es el largo tiempo que toma el enfermo en aceptarlos, a pesar de que los órganos utilizados comparten su misma información genética, pues casi siempre provienen de miembros de la misma familia. Por otra parte, cuando se produce rechazo al tejido transplantado, la salud del individuo queda seriamente comprometida y hay la eventualidad que se debe pensar en un nuevo transplante.
Algunos hallazgos recientes han revolucionado la biología de las células madre y han demostrado su potencial clínico para tratar diversas enfermedades, como trastornos neurodegenerativos, desórdenes sanguíneos y diabetes. Además, una estrategia válida para el manejo de desórdenes de origen genético conocido, como la anemia falciforme y la ß-talasemia, consiste en utilizar la técnica de transferencia nuclear, combinada con terapia génica y celular.
Los defensores de la clonación terapéutica de células humanas aducen que permite disponer de tejidos y de órganos viables, a partir de una fuente de ADN, sin que sea necesario traer un nuevo ser al mundo con el único fin de obtener un tejido. Con la finalidad de asegurar la normalidad del clon y, por tanto de las células madre embrionarias, se propone una "prueba o test de seguridad" que seleccione y discrimine los embriones a los que se les permitirá progresar en su desarrollo. En teoría, este filtro se podría efectuar mediante la evaluación de los errores en la expresión y en la huella genética de los blastómeros en estado de preimplantación, pero no tiene en cuenta que se desconocen los efectos epigenéticos adversos que desencadenaría tal manipulación.
A partir de ciertos órganos o tejidos de individuos postnatales, se pueden aislar células que pueden persistir en forma indiferenciada. Estas células podrían ser transformadas en células madre pluripotenciales y cultivadas separadamente, de acuerdo a la necesidad del paciente.
Así, dentro de tejidos clásicamente considerados con un potencial regenerativo nulo, como el nervioso y el muscular, se han identificado grupos de células madre, capaces de proliferar y de madurar hacia diferentes tipos celulares, tanto in vivo como in vitro. De la misma manera, en la zona subventricular del cerebro adulto, se han hallado células madre que eventualmente se podrían utilizar en terapias de reemplazo neuronal. Por otro lado, se observa una buena regeneración de tejidos como músculo esquelético lesionado, cuando se injertan mioblastos cultivados in vitro.
Otra fuente prometedora de células pluripotenciales es la sangre del cordón umbilical. La muestra de sangre se obtiene en el momento del nacimiento, sin que el neonato ni su madre se vean afectados. La eficiencia del procedimiento es tal, que, a partir de un volumen de 20 ml de sangre del cordón, se obtienen hasta 4 millones de células madre67, que pueden crioconservarse por largo
tiempo sin deterioro alguno, para ser utilizadas en transplantes y en procesos de terapia génica. La sangre del cordón umbilical también provee hematíes normales y leucocitos muy útiles en el tratamiento de la anemia falciforme y en la restauración del sistema inmunitario de los niños nacidos con inmunodeficiencia grave.
Si las células madre que provienen de determinados órganos de individuos adultos, se cultivan en condiciones apropiadas, son susceptibles de sufrir transdiferenciación. En 1999, un grupo de científicos italianos y canadienses demostraron la presencia, en personas adultas, de células madre nerviosas capaces de diferenciarse en células hematopoyéticas. Según sus hallazgos, la diferenciación de las células madre estaría condicionada por las señales que reciben del entorno donde se sitúan. Igualmente se ha determinado que células madre nerviosas de ratones se pueden diferenciar hacia células hemáticas, como también las células hemáticas en células musculares esqueléticas, o bien, en células de microglia o de astroglia. Estos hechos sugirieron la posibilidad que células madre de la médula ósea fueran transplantadas con el fin de tratar enfermedades como distrofia muscular, mal de Parkinson, infarto de miocardio o falla hepática. Sin embargo no es claro si la aparente plasticidad de las células madre adultas examinadas se debe a las condiciones particulares en las que se cultivaron, a posible contaminacióno a fusión celular. Además de esta incógnita que retrasa su empleo como donantes en la clonación, se ha observado que las células madre adultas presentan otra serie de desventajas con respecto de las células madre embrionarias. Tales desventajas incluyen no sólo dificultades en su aislamiento y cultivo, sino también una alta probabilidad de sufrir mutagénesis insercional y cáncer, como resultado de la introducción de transgenes retrovirales, necesarios para su manipulación genética. En contraste, las células madre embrionarias se obtienen fácilmente a partir del embrión seleccionado, proliferan de modo indefinido en cultivo, y sus defectos genéticos se pueden reparar mediante procesos de recombinación homóloga. Recientemente se obtuvieron células madre adultas derivadas de tejido mesenquimatoso de médula ósea en ratas, ratones, otros animales y seres humanos, que sufrieron una rediferenciación exitosa hacia células de las tres capas germinativas (ecto, meso y endodermo), cuando se transfirieron sus núcleos dentro de blastocistos.
Hay otras fuentes que ofrecen disponibilidad de células madre pluripotenciales, que se pueden diferenciar y cultivar separadamente: Son los embriones desechados durante el procedimiento de fertilización in vitro (IVF).
Clonación reproductiva. Inicialmente, el proceso es igual al que se efectúa
durante la clonación terapéutica. La diferencia aparece con posterioridad a la fusión del núcleo de la célula donante con el oocito enucleado, pues el cigoto se debe implantar en un útero, donde se desarrollará hasta formar un individuo réplica del donante.
Fig.17. El esquema representa la técnica de transferencia nuclear con fines reproductivos
Se toma el núcleo de alguna célula del cuerpo del animal que se quiere clonar (animal A). Ese núcleo tiene toda la información genética que determina las características de ese individuo. Este núcleo se introduce en un óvulo de otro individuo al que previamente se le quitó el núcleo (animal B). De esta forma, se obtiene una célula que se asemeja a un cigoto. Este cigoto realiza in vitro las primeras divisiones mitóticas hasta convertirse en embrión de unas pocas células y entonces es implantado en el útero de una madre adoptiva (animal C). A partir de ese cigoto se desarrolla un individuo exactamente igual a aquel individuo que donó su material genético. En total son necesarios 3 animales: el que se quiere clonar que aporta el núcleo, una hembra que aporta óvulos y otra adoptiva que llevará a cabo la preñez.
Existe otra técnica de clonación, denominada “clonación por fusión nuclear” que es similar a la anterior pero en lugar de tomar el núcleo de la célula, se fusiona una célula completa del animal que se quiere clonar (animal A) con un óvulo de otro animal (B) al que se le ha extraído el núcleo. Esa fusión genera un óvulo con toda la carga cromosómica completa, es decir, un cigoto, el cual se desarrollará en embrión in vitro y luego será implantado en una madre adoptiva (animal C).
Cuando se quieren tener muchos animales transgénicos idénticos que produzcan la misma proteína recombinante de interés, se recurre a la clonación reproductiva. Esta técnica permite obtener individuos genéticamente idénticos al animal deseado.
La clonación utilizando células somáticas sin transformar ha demostrado la utilidad en generar clones de animales individuales de alto mérito genético; esto combinado con la tecnología de ADN recombinante da lugar a la generación de animales clónicos transgénicos de alto mérito genético, que es posible mediante la incorporación de los genes de interés a líneas celulares mediante transfección, las cuales pueden ser utilizadas como donantes de núcleos en la transferencia nuclear.
A diferencia de la microinyección pronuclear, donde sólo un 3-5% de los animales nacidos son transgénicos (cifra que es inferior en animales mayores),
la transferencia nuclear asegura que el 100% de los animales nacidos sea transgénico, eliminándose, por lo tanto, una generación de animales.
Además, estos animales presentan un bajo índice y/o ausencia total de mosaicismo. Esto permite producir varios animales transgénicos en la primera generación, posibilitando hacer pruebas de expresión del transgen en un grupo de animales mientras el resto se utiliza para propagar la línea. En forma adicional es posible seleccionar el sexo del animal sin necesidad de incurrir a biopsias del embrión, lo que permitiría incrementar la masa ganadera por multiplicación (clonación) en forma más rápida y eficiente. Finalmente, la posibilidad de recombinación homóloga (gene targeting) en células somáticas previo a la transferencia nuclear abre infinitas posibilidades de manipulación genética en animales de granja que habían sido restringidas sólo al ratón, a través de recombinación homóloga en células madre embrionarias. Esto permitirá expandir el horizonte de posibilidades a esta tecnología, posibilitando la eliminación de genes de interés en el animal (gene knock out), como, por ejemplo, la eliminación del gen del cerdo responsable del rechazo a los trasplantes de órganos (Phelps y col., 2003; Ramsoondar y col., 2003) o la eliminación del gen de la oveja responsable de la producción de priones (Denning y col., 2001), además de la posibilidad de insertar genes específicos en regiones definidas del genoma del animal, favoreciendo un sitio permisivo para asegurar altos niveles de expresión de la proteína de interés (McCreath y col., 2000).
Fig.18. Rutas para la producción de animales transgénicos
En el campo de la clonación animal con fines reproductivos existe consenso sobre las bondades de efectuar el procedimiento en animales de granja, con la
finalidad de preservar el genoma de los mejores ejemplares. Es lo que se ha llamado comúnmente clonación de animales de élite.
Además de proporcionar una ruta para la generación de animales transgénicos, la transferencia nuclear podría utilizarse para la producción de cantidades ilimitadas de animales genéticamente idénticos con cual la posibilidad de multiplicar razas de animales seleccionados podría aumentar la eficiencia de la productividad pecuaria.
Las características genéticas más valoradas son, entre otras, un crecimiento rápido, resistencia a enfermedades, una elevada producción de leche o de lana de alta calidad.
Una ventaja importante de la clonación sería la diseminación más rápida del progreso genético desde rebaños elite hacia los productores. Hasta la fecha esto se ha venido realizando mediante la inseminación artificial, la cual suministra sólo la mitad de los genes. Con la clonación, los productores que pudieran pagar este servicio recibirían embriones que serían clones de las vacas más productivas de los rebaños elite, con lo que incrementarían la performance de sus rebaños en tan sólo una generación. En este escenario las empresas venderían embriones clonados de la misma forma en que hoy comercializan el semen. Estos embriones tendrían la ventaja de un transporte más fácil de los genotipos entre países, evitándose los inconvenientes de la cuarentena. Aunque los rebaños de algunos productores pudieran consistir sólo de animales clonados, el hecho de que estos fueran clones de diferentes animales elite incrementaría la diversidad genética en estos predios.
La clonación reproductiva también permite preservar especies exóticas o que se encuentren en peligro de extinción. Aunque la transferencia nuclear se asocia en la mente de la gente con una pérdida de la diversidad genética, esta técnica también proporciona nuevas alternativas para la conservación genética. Con una cada vez más creciente presión comercial, muchas razas indígenas o criollas adaptadas a las condiciones locales están siendo reemplazadas por razas comerciales sujetas a sistemas intensivos de producción.
Estas razas locales pueden contener importantes genes que confieran resistencia a enfermedades y resistencia a las condiciones climáticas (frío/calor). Hay, por tanto, una urgente necesidad por prevenir su extinción. Los métodos actuales de conservación consisten en almacenar semen o embriones congelados, procesos que son largos y costosos. Como consecuencia, el futuro de sólo unas pocas razas está asegurado. La tecnología de clonación puede proporcionar una forma más simple y efectiva de conservar estas razas, por cuanto muestras de sangre, biopsias de piel o incluso pelo pueden ser utilizadas como fuentes de células que podrían ser crecidas brevemente en el laboratorio, mantenidas y congeladas mediante su almacenamiento en nitrógeno líquido para ser luego utilizadas en experimentos de transferencia nuclear. El mejor ejemplo del potencial de esta tecnología lo demuestran los recientes experimentos en diversas especies en peligro de extinción mediante transferencia nuclear interespecies (Lanza y col., 2000; Kitiyanant y col., 2001; Loi y col., 2001; Lee y col., 2003).