Se recolectaron 2 mL de saliva en viales del kit Oragene·RNA (DNA Genotek), que facilita la liberación del ARN de la saliva y lo estabiliza.
Se incubó la muestra de saliva en un baño a 50ºC durante 1 hora. A continuación, se siguieron las instrucciones del protocolo Oragene·RNA Purification (DNA Genotek) para realizar una purificación inicial de una alicuota de 1 mL de saliva. Inmediatamente, se siguieron las instrucciones del protocolo de purificación “Total
RNA Isolation from Animal Cells” del kit RNeasy Micro kit (Qiagen). Se obtuvieron 50
µL de ARN de cada muestra.
Se determinó la concentración y pureza del ARN total mediante la medición de la aborbancia a 260 (A260) y 280 (A280) nm en un espectrofotómetro (UV-VIS NanoDrop 1000, Thermo Scientific).
2.4.3.2 Retrotranscripción
Para sintetizar una cadena complementaria de ADN (ADNc) a partir de ARN se utilizó la transcriptasa inversa SuperScript II RT (Lifetech).
La síntesis de ADNc se realizó mezclando 1 µL de cebadores aleatorios (random) p(dN)6 100 µM (Roche), 500 ng de ARN y 1 µL de dNTPs (10 mM de cada dNTP) (Lifetech), hasta un volumen final de 12 µL. Se calentó la mezcla a 90ºC (5 min) y rápidamente se enfrió en hielo. Se añadieron 4 µL de tampón 5X First Strand, 2 µL de DTT 0,1 M y 1 µL de RNase OUT (40 UDS/µL) (Lifetech). Se incubó la mezcla a 25ºC (2 min) y se añadió 1 µL de SuperScript II RT (200 UDS) (Lifetech). Finalmente, se incubó en un termociclador Applied Biosystem Gene Amp PCR System 9700 utilizando el siguiente programa: 1) 25ºC (10 min); 2) 42ºC (50 min); 3) 70ºC (15 min); 4) conservación a 15ºC.
2.4.3.3 Análisis de fragmentos marcados fluorescentemente
Para analizar el efecto de la mutación de splicing en el paciente y determinar el tamaño del transcrito se hizo una PCR a partir de los productos de retrotranscripción. Se diseñaron los cebadores que aparecen en la Tabla 5, que son específicos de ADNc para evitar la amplificación de posible ADN genómico (ADNg) contaminante.
El cebador directo se encontraba en el exón 1, y el cebador inverso, marcado con un fluoróforo en el extremo 5’, estaba en el exón 2. El marcaje del cebador permitió determinar el tamaño del fragmento amplificado en un analizador genético.
Materiales y métodos
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El intrón 1 del gen GJB2 tiene un tamaño de 3,1 kb, por lo que con el programa de PCR utilizado (que utiliza una extensión de solamente 30 seg), sería prácticamente imposible obtener un producto a partir de un hipotético ADN genómico residual. Solamente se obtendría amplificación del ADNc.
Para la amplificación se utilizó polimerasa Fast Start (Roche), MgCl2 1,5 mM y solución GC-RICH, y el programa: 1) desnaturalización a 95º C (5 min); 2) 40 ciclos de desnaturalización a 94ºC (30 seg), hibridación a 60ºC (30 seg) y extensión a 72ºC (30 seg); 3) extensión a 72ºC (7 min); 4) conservación a 15ºC. Los productos se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Según el rendimiento obtenido, se hizo una dilución del producto de PCR. Se tomó 1 µL de esta dilución y se mezcló con 12 µL de formamida y 0,2 µL de ROX (marcador de peso molecular, Applied Biosystems). Se desnaturalizó durante 5 min a 95ºC y se resolvió por electroforesis capilar en un analizador genético ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems).
Tabla 5.Secuencias de los cebadores utilizados para amplificar la región del sitio de splicing de GJB2.
Cebadores Secuencia (5' 3')
INI26-A2 CGCGCTCCTCTCCCCGACT
INI26-B2 (FAM)-GATCCTCGTTGTGGCTGCAAAGGA
2.4.3.4 Secuencia de los transcritos generados en individuos con la mutación c.-22-2A>C
Se realizó una PCR a partir de los productos de retrotranscripción. Se siguieron las condiciones de PCR descritas en el apartado 2.4.3.3, pero utilizando el cebador inverso INI26-B2 sin marcar. Los productos obtenidos fueron comprobados en un gel de agarosa al 1,5% y fueron extraídos utilizando el kit NucleoSpin Extract II Macherey- Nagel, siguiendo las instrucciones del fabricante. El producto purificado fue secuenciado siguiendo las condiciones descritas en el apartado 1.4.
En paralelo, los productos de PCR obtenidos se clonaron en un vector pCRR2.1- TOPOR empleando el kit comercial de clonación TOPO TA Cloning (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. El producto obtenido se utilizó para transformar un cultivo de células competentes de E. coli estirpe DH5α (Invitrogen) siguiendo el protocolo de transformación de Maniatis et al, 1982. Posteriormente las células transformadas se plaquearon en medio Luria Bertani con ampicilina (1µg/mL) y X-Gal (1 mg), y se incubaron a 37ºC durante 16 h. Crecieron colonias resistentes a ampicilina de color blanco y azul. Se reestriaron solamente las colonias blancas, que
Materiales y métodos
son aquellas que corresponden a las células transformadas con el vector portador del inserto.
La extracción del plásmido se realizó utilizando el kit NucleoSpin Plasmid (Macherey Nagel) siguiendo las instrucciones del fabricante. El inserto del plásmido purificado fue secuenciado utilizando los cebadores INI26-A2 e INI26-B2 sin marcar.
2.4.3.5 PCR cuantitativa
Se diseñó un ensayo de PCR cuantitativa (PCR a tiempo real) para analizar el efecto que tendría la mutación c.-22-2A>C sobre la expresión del gen GJB2.
Los ensayos de PCR cuantitativa permiten la amplificación por PCR, la detección del producto (fluorescencia) y la cuantificación del ADN sintetizado. La cantidad de fluorescencia es directamente proporcional a la cantidad de producto y se cuantifica en cada ciclo.
Estos ensayos fueron llevados a cabo utilizando el 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems). La amplificación de este ADNc se realizó utilizando cebadores específicos diseñados por el programa Primer Express Software (Applied Biosystems). La secuencia de estos cebadores se muestra en la Tabla 6.
La cuantificación se logra mediante la comparación de la expresión del gen en la muestra problema respecto a la expresión de dicho gen en una muestra control. Además, los valores se normalizan utilizando genes endógenos como control. En nuestro caso se utilizó el gen GAPDH.
Tabla 6.Secuencias de los cebadores utilizados en la PCR cuantitativa.
Fragmentos Cebadores Secuencia (5' 3')
GJB2 sitio splicing normal A TCCCGACGCAGAGCAAAC
B TGCAGCGTGCCCCAAT
GJB2 sitio splicing alternativo 1 A TCCCGACGCAGCTAGTGAT
B GCGGTTTGCTCTGGAAAAGA
GAPDH A GGTCGGAGTCAACGGATTTG
B AAACCATGTAGTTGAGGTCAATGAAG
Se prepararon diluciones seriadas de las muestras de los productos de retrotranscripción. Cada reacción se realizó por duplicado para hacer el estudio más robusto.
Se mezclaron 0,8 µL de cada cebador (10 µM), 0,4 µL de ROX Reference Dye (kit SYBR Green qPCR, TaKaRa) y 3 µL de H2O. Después se añadieron 10 µL de SYBR Green. La mezcla se añadió a las diluciones de ADNc.
Materiales y métodos
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El programa empleado fue el siguiente: 1) 50ºC (2 min); 2) 95ºC (10 min); 3) 60 ciclos de desnaturalización a 95ºC (15 seg), hibridación a 59ºC (30 seg) y extensión a 72ºC (30 seg); 4) finalmente se añadió un ciclo de disociación a 95ºC (15 seg), 60ºC (30 seg), 95ºC (15 seg). Se tomó una única medida de fluorescencia una vez finalizada la extensión del paso 3.
Se realizan tres reacciones, partiendo cada una de una cantidad diferente de ADNc (25 ng, 125 ng y 625 ng, respectivamente). Se ensayan a la vez el gen o transcrito en estudio y un gen de referencia. Y se trabaja a la vez con una muestra control y la muestra problema.
Los datos de fluorescencia son procesados mediante el software del termociclador, el cual proporciona directamente los valores necesarios para la cuantificación:
- los valores de umbral de ciclo (CP) de cada reacción. Se define el umbral de ciclo como el punto en el cual la fluorescencia sube apreciablemente por encima del ruido de fondo.
- La pendiente de la recta obtenida al representar los valores de CP en función de la cantidad de ADNc de partida.
Para realizar la cuantificación de la expresión relativa del gen o transcrito en estudio se empleó el método de Pfaffl, 2001, el cual compara la expresión del gen en estudio frente a la expresión de un gen de referencia (gen GAPDH) por medio de la siguiente relación:
Egen en estudio = Eficiencia de la PCR del gen o transcrito en estudio = 10-1/pendiente Egen de referencia = Eficiencia de la PCR del gen de referencia = 10-1/pendiente
∆CPgen en estudio = CP de la muestra control – CP de la muestra problema (para el gen en estudio)
∆CPgen de referencia = CP de la muestra control – CP de la muestra problema (para el gen de referencia)
(E
gen en estudio)
∆CPgen en estudio(E
gen de referencia)
∆CPgen de referenciaMateriales y métodos
3. Locus DFNB24: gen RDX