Se han descrito más de 100 mutaciones patogénicas en la región codificante del gen GJB2. Sin embargo, hasta la fecha se conocía una sola mutación que afectara a los sitios de splicing, lo cual se explica por la sencilla estructura del gen, con sólo dos exones. En este trabajo hemos identificado una segunda mutación, que parece ser responsable de un fenotipo de hipoacusia leve o moderada.
La primera mutación de splicing que se describió en GJB2 fue una mutación en el sitio donador del intrón 1 (c.-23+1G>A, IVS1+1G>A). Se encontró en heterocigosis compuesta con otra mutación en la región codificante de GJB2 (Sirmaci et al., 2006). Debido a que el gen GJB2 tiene solamente dos exones, y a que el segundo contiene la región codificante completa (Kiang et al., 1997), esta mutación no tiene efecto sobre el marco de lectura. Sin embargo, la secuenciación del ADNc de una línea celular linfoblastoide generada a partir de un individuo heterocigoto no detectó el transcrito correspondiente al alelo c.-23+1G>A. Esto sugería que no se transcribía o que el transcrito era muy inestable (Shahin et al., 2002). Esta mutación es muy frecuente en Mongolia (50% de los cambios patogénicos DFNB1) (Tekin et al., 2010), y relativamente frecuente (2-9,4% de todos los alelos DFNB1 patogénicos) en las poblaciones checa, polaca, turca, kurda y china (Seeman et al., 2006; Pollak et al., 2007; Denoyelle et al., 1999; Mahdieh et al., 2004; Yuan et al., 2010).
En esta tesis hemos identificado una nueva mutación en el sitio aceptor de splicing del intrón 1 del gen GJB2 (c.-22-2A>C, IVS1-2A>C). La mutación se encontró en tres hermanos de una misma familia, en heterocigosis compuesta con la mutación c.35delG. Los tres hermanos presentaban una hipoacusia no sindrómica postlocutiva y moderada. Investigamos los efectos de la mutación mediante RT-PCR a partir de ARN extraído de saliva de un individuo heterocigoto compuesto c.-22-2A>C/c.35delG. Los transcritos generados al utilizarse el sitio aceptor de splicing normal fueron detectados solamente a partir del alelo c.35delG, indicando que, como cabía esperar, la mutación c.-22-2A>C destruye este sitio aceptor. Sin embargo, sí que se detectaron transcritos correspondientes al alelo c.-22-2A>C. Se trataba de transcritos más largos, que incorporaban secuencias intrónicas de 38 o 34 nucleótidos, debido al uso de dos sitios aceptores alternativos (denominados 1 y 2, respectivamente). El transcrito con 38 nucleótidos adicionales es observable en individuos control, aunque en muy pequeña cantidad. Cuando el sitio aceptor normal es inactivado por la mutación, el uso del sitio alternativo 1 se incrementa (relación 1,68:1); además, se manifiesta el uso del sitio alternativo 2. Como la inserción de los 34 o 38 nucleótidos intrónicos no implica a la región codificante, la expresión residual que se alcanza parece suficiente para retrasar el inicio de la hipoacusia y disminuir la pérdida auditiva.
Discusión
Los estudios de correlación genotipo-fenotipo en pacientes con hipoacusia de tipo DFNB1 han evidenciado que se trata de una hipoacusia mayoritariamente prelocutiva, con un grado de pérdida auditiva muy variable (de leve a profunda), estable o ligeramente progresiva, y sin malformaciones de oído interno asociadas (Cohn et al., 1999; Denoyelle et al., 1999; Snoeckx et al., 2005). En un estudio multicéntrico realizado sobre datos genéticos y audiológicos de más de 1.500 individuos de 16 países, las mutaciones fueron clasificadas como truncantes o no truncantes para investigar si el tipo de mutación guardaba relación con sus efectos fenotípicos. Entre las truncantes se incluyeron las que generan codones de parada prematuros en GJB2, la deleción del(GJB6-D13S1830) y la mutación de splicing c.-23+1G>A. Las no truncantes incluían a las mutaciones missense y a las pequeñas deleciones en fase. Se constató que la hipoacusia de tipo DFNB1 es mayoritariamente severa o profunda, aunque también incluye fenotipos leves y moderados, y que la variabilidad en el grado de pérdida auditiva se observaba incluso en pacientes con el mismo genotipo (por ejemplo, homocigotos c.35delG). Pero se descubrió una correlación que había pasado desapercibida hasta entonces: tomando los datos en conjunto, el grado de hipoacusia asociado a la presencia de dos mutaciones truncantes era significativamente más grave que el asociado a dos mutaciones no truncantes, y el grado de hipoacusia asociado a genotipos truncante/no truncante era intermedio entre los dos grupos anteriores (Snoeckx et al., 2005). Aunque un mismo genotipo pudiera dar lugar a pérdidas auditivas de distinta gravedad, se observó que unas pocas mutaciones de sustitución de aminoácido (p.L90P, p.M34T, p.V37I) siempre estaban asociadas con hipoacusias leves o moderadas de manifestación postlocutiva tardía. A este pequeño grupo de alelos hipomórficos parece añadirse ahora la mutación c.-22-2A>C descubierta en el curso de este trabajo. Los tres hermanos portadores del genotipo c.- 22-2A>C/c.35delG presentan una hipoacusia postlocutiva moderada. Indudablemente, la correlación es aún débil: el número de individuos que llevan esta mutación es demasiado pequeño, y todos son miembros de la misma familia. Pero es también cierto que no se observa variabilidad fenotípica entre los tres afectados y que los efectos de la mutación a nivel molecular apoyan que se trate de un alelo hipomórfico.
El hallazgo de nuevos casos con esta mutación pondrá a prueba la correlación propuesta. La mutación ha sido encontrada solamente en una familia, por lo que podría ser poco frecuente. Otra posibilidad es que, si la correlación genotipo-fenotipo que proponemos se confirma, la mutación podría estar poco representada en las series de pacientes estudiadas hasta ahora, la mayoría de las cuales presentan un claro sesgo hacia la colección de individuos con pérdidas auditivas graves.
Discusión
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2. Hipoacusias no sindrómicas de tipos DFNB24, DFNB28, DFNB29 y DFNB49