Se adicionó al pellet 1,6ml de Polietilenglicol al 50% de RPMI-0 en un minuto, se colocó en agitación por un minuto y se adicionó RPMI-0 hasta completar 10ml de volumen final durante 7 minutos en agitación. Se centrifugó a 2500rev/min por 15 minutos y se resuspendío el pellet en medio RPMI suplementado con HAT al 15% SFB. Finalmente se plaqueo colocando 70µl en cada pozo de las cajas de 96 pozos y se mantuvo en incubación en un ambiente de 37°c y 5% CO2. (Morgan S & Darling D, 1995); se revisó los
pozuelos cada dos días para evaluar viabilidad de la fusión y 10 días después se realizó la prueba de ELISA-DOT para comprobar la reactividad de los hibridomas contra la Leptospira pomona.
Contaminación: Los pozuelos se revisaron en busca de
contaminación día de por medio, macroscópicamente se buscaba cambios de color, presencia de cuerpos extraños o turbidez de los pozuelos (ver Figura 5); microscópicamente se buscaba presencia de bacterias u organismos diferentes a los hibridomas. Cuando se encontraba presencia de contaminación, se procedía a inocular 100µl de hipoclorito puro al pozuelo afectado y la caja era separada de las cajas sin contaminación de pozuelos; Cuando la contaminación superaba el 75% de la caja, esta era descartada.
Figura 5. Evaluación macroscópica post fusión. Fuente autores
Hibridomas: Después de la fusión, y sembrar los hibridomas en medio RPMI suplementado con HAT al 15% SFB, estas se incubaron a 37°C y 5%CO2, el día 01 de diciembre, el 07 de diciembre y el 11 de diciembre se hizo revisión del crecimiento celular evaluando la densidad celular presente en los pozuelos; se realizó un promedio primero entre los pozuelos de cada caja y posteriormente las cajas de cada ratón, obteniendo la viabilidad y densidad de los hibridomas obtenidos por la fusión realizada.
La densidad fue evaluada por el espacio por pozo ocupado por los hibridomas; y la viabilidad de los hibridomas fue probada por las mismas formulas que se utilizaron en la prueba de viabilidad de células de mieloma, teniendo en cuenta que los hibridomas vivos son redondeados, transparentes y refringentes.
RESULTADOS
A continuación se presentan los resultados obtenidos en el proyecto, divididos según la etapa de estudio: elaboración del inóculo, esquemas de inoculación, fusión celular y post-fusión.
Elaboración del inóculo: el cultivo de Leptospira pomona tuvo un
crecimiento rápido y constante, pudiendo realizar los pases aproximadamente cada 3-5 días, las Leptospiras se encontraban móviles y de buen tamaño.
Al realizar la prueba de Lowry, se encontró una proteína antigénica de 3.30mg/ml en el antígeno A y 4.11mg/ml en el antígeno B, se obtuvo 21 viales de cada antígeno con contenidos de 1ml/vial, los cuales fueron mantenidos en refrigeración hasta su uso.
Inoculación: la inoculación se llevó a cabo sin inconvenientes, el ratón B
presento decaimiento por unas horas post-inoculación en todas las inoculaciones, las cuales se llevaron a cabo en las fechas establecidas; en la sexta inoculación del ratón A y quinta inoculación del ratón B, se obtuvieron los resultados esperados de anticuerpos para el sacrificio de los ratones; pero como ya se indicó se presentaron fallas técnicas con la incubadora de CO2. Ajenas a la voluntad de los autores del proyecto, que motivaron la
administración de más inoculaciones. El ratón P, presentó decaimiento progresivo 4 días después de la quinta inoculación con Antígeno crudo y muere al 5 día post inoculación.
En la Figura 6, se puede observar los resultados obtenidos en la última prueba ELISA-DOT realizada a los ratones A y B, donde se encuentra que presentaron títulos de 1:16384 en el ratón A y 1:32768 en el ratón B; la siguiente prueba arrojo resultados falsos; y el MAT arrojo resultados de 1:32768 en ambos casos.
Figura 6. Resultados prueba ELISA-DOT. Fuente autores
Fusión:
Esplenocitos: Al realizar el conteo de los esplenocitos obtenidos tras
el sacrificio y extracción del bazo, se encontraron los resultados que pueden ser observados en la tabla 2; donde se observa un mayor número de celularidad obtenida del ratón A y P1 con respecto al ratón B.
Tabla 2. Número total esplenocitos.
ESPLENOCITOS Células Ratón A 27´875.000 Ratón B 16´750.000 Ratón P1 23´125.000 Nota. Fuente Autores
Células mieloma: En la tabla 3 se puede observar la cantidad de
células de mieloma encontradas los dos días de la fusión; el día 26 de noviembre donde se realizaron las fusiones de los ratones A y B; y el día 03 de enero cuando se realizó la fusión del ratón P1.
Tabla 3. Resultados células mieloma.
CÉLULAS MIELOMA NÚMERO Células 26-nov 24´625.000 03-ene 20´975.000 VIABILIDAD % 26-nov 55 03-ene 75
Nota. Fuente Autores
La viabilidad de las células fue 75% para la fusión de los ratones A y B, mientras que la viabilidad para la fusión del ratón P1 fue del 55%.
Post-fusión:
En fusión celular se encuentra el porcentaje de fusión, evaluado por el número de hibridomas viables encontradas en la revisión y la densidad promedio encontrada, así como la contaminación presentada.
Al realizar el ELISA-DOT el día 10 de diciembre, se obtienen resultados negativos a todos los pozos además del control positivo (ver figura 7), así que el día 14 de diciembre se realiza la prueba de ELISA indirecto donde se encuentran 4 sospechosos pero no positivos; por lo cual todos los sobrenadantes de los hibridomas en las dos fusiones se toman como negativos, considerándose terminado el ensayo.
Figura 7. ELISA- DOT. Fuente autores
Ratón P1: La fusión realizada con los esplenocitos del Ratón P1 se
tomó como contaminada y se descartó todas las cajas, al encontrar más del 75% de contaminación de los pozuelos.
Densidad hibridomas: la densidad encontrada en el cultivo post-
fusión (ver tabla 4) fue alto en ambos ratones, siendo el promedio del ratón A más alto que el encontrado en el ratón B.
Tabla 4. Resultados Densidad Hibridomas
RESULTADOS OBTENIDOS