Research approach

Los vectores utilizados en este trabajo fueron construidos amplificando el gen glenth

completo (o solo el dominio ENTH)desde el vector pGlENTHp-HA (ver M & M SECCIÓN 6.3.9) y clonado por recombinación homóloga en levaduras, en el vector multicopia HIS3 o URA3 bajo el promotor MET25. La recombinación homóloga se llevó a cabo entre el plásmido pMET25.423 o

pMET25.426 y el producto amplificado por PCR. En primer lugar, para clonar el gen glenth en estos vectores se diseñaron cebadores específicos (verTABLA 6.10), los cuales contienen en un

extremo 24 pb correspondiente a la secuencia que posee homología con el vector pMET25.423 (en gris en la TABLA 6.10), seguida de una secuencia de 24 pb correspondientes a glenthp 423 (en rosa). En el caso del cebador sentido, entre las dos secuencias se ubican los pares de bases correspondientes a la etiqueta de 6xHis (en naranja). Paralelamente a la amplificación de glenth a través de PCR (tal como fue descripto en la SECCIÓN 6.3.1), los vectores pMET25.423 o

pMET25.426 se linealizaron con 2,5 µl del Buffer 4 al 10X + 2,5 µl de BSA al 10X + 1 µl EcoRI + 1 µl

XmaI + 7,5 µl H2O durante 3 hs a 37°C. Luego, el producto de PCR y los vectores mediante

FIGURA 6.5:PLÁSMIDOS PARA SOBRE-EXPRESAR GLENTHP EN LEVADURAS. Se muestra la representación esquemática de los vectores pGlENTHp-mCherry(HIS3) a la izquierda y pGlENTHp-mCherry(TRP1) a la derecha, en los cuales el gen glenth (en rosa en el esquema) se clonó por recombinación homóloga en los plásmidos

pMET25.423(pUG34) y pMET25.426(pUG36), respectivamente. Ambos son vectores de expresión de alta copia, presentan el origen de replicación de un plásmido natural de S. cerevisiae (círculo de 2 µ) y una secuencia promotora MET25 (en azul). La proteína de fusión generada posee una etiqueta mCherry en el C-terminal (mCherry se muestra en rojo) y otra de 6xHis en el N-terminal (no se muestra en este dibujo). Además, el vector pUG34 posee como marcador HIS3 (en celeste brillante), mientras que pUG36 presenta URA3 (en verde brillante), que codifican para genes necesarios para la síntesis histidina o uracilo, por lo que la presencia del plásmido le permitirá a las levaduras transformadas crecer en medios axótrofos para HIS3 y URA3, respectivamente.

124 electroforesis en geles de agarosa, como se describió en la SECCIÓN 6.3.1. Finalmente, se procedió a transformar las levaduras con el inserto y vector lineal, para que tenga lugar la recombinación homóloga entre ellos, tal como se ilustra en la FIGURA 6.6.

TABLA 6.10:SECUENCIA DE CEBADORES UTILIZADOS PARA EXPRESAR GLENTHP O GENTH EN LEVADURAS

Cebadores Secuencia (5´ 3´)

GlENTHpMET25Fw TCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGATGCATCATCATCATCATCACCCTGCGAAGGAGAACATGCAGAAC

GlENTHpMET25Rv ATCGATAAGCTTGATATCGAATTCAAAGAAGGACATGAGGTCGGCTAT

gENTHMET25Rv ATC GATAAGCTTGATATCGAATTCGGCATACCTTTGACGTGTATCTGC

Fw: sentido. Rv: antisentido. En gris se representa la secuencia que posee homología con el vector. En rosa las 24 pb correspondientes a la secuencia de GlENTHp. Con naranja, se representa la etiqueta de histidina.

FIGURA 6.6: DIAGRAMA QUE ILUSTRA EL PROCEDIMIENTO PARA GENERAR EL VECTOR PGLENTHP- MCHERRY (HIS3).

El gen glenth (en rosa) se amplificó a partir del vector de expresión

pGlENTHp-HA, utilizando cebadores específicos que poseen en el extremo 5` regiones idénticas (en el esquema en gris y rojo) al vector

pMET25.423 (pUG34), con el cual que se va a producir la recombinación. Para que este procedimiento tenga lugar es necesario que el vector se encuentre linealizado. Finalmente, se generó el plásmido pGlENTHp- mCherry (HIS3) por recombinación homóloga en las levaduras salvajes. También se ilustra, en el cebador sentido, la etiqueta de 6xHis (en color naranja) que posee la proteína de fusión en el extremo N-terminal.

125 La sustitución de aminoácidos puntuales, también se realizó como se describió en la SECCIÓN 6.3.2, empleando QuikChange XL site-directed mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA).

Todas las enzimas de restricción utilizadas son de New England Biolabs (Ispwich, MA). En todos los casos, las levaduras se transformaron con el método Acetato de Litio (LiAc), siguiendo las instrucciones del manual para levaduras de Clontech. Brevemente, luego del tratamiento de las células con 0,1 M de LiAc-TE [se prepara al momento de usar, mezclando: 0,5 ml de Tampón TE 10X (Tris-HCl 0,1M y EDTA 10 mM a pH 7,5) con 0,5 mL de LiAc 1 M a pH 7,5 en 4 mL de agua destilada], para lograr la permeabilización de la pared celular, se adicionaron: 10 µL de DNA de esperma de salmón desnaturalizado (10 mg/ml), 5 µL del plásmido a transformar y 50 µL de la suspensión de células. A continuación, se añadieron 300 µL ml de solución PEG estéril recién preparada mezclando: 1,5 mL de tampón TE 10X con 1,5 Ml de Acetato de litio 1 M pH 7,5, más 12 mL de Polietilénglicol 4000 al 50% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US). Luego, las células se incubaron toda la noche a temperatura ambiente, en agitación. Al día siguiente, las células transformadas se centrifugaron a máxima velocidad durante 10 seg y, luego de eliminar el sobrenadante, se distribuyeron en placas conteniendo los medios selectivos necesarios para casa caso. El crecimiento de las levaduras transformadas se evaluó luego de incubar las placas por 3 días a 30°C, mediante la observación al microscopio de colonias con células fluorescentes rojas. Una vez confirmadas las transformaciones, se rescataron los vectores de las levaduras. Este procedimiento involucra la selección de una colonia positiva que luego se repica y se deja crecer durante toda la noche a 30°C en medio sólido y con la selección adecuada. Al día siguiente, las células presentes en la placa de cultivo se resuspendieron en 250 µL de solución A [sorbitol al 1M, citrato de sodio al 0,1 M y EDTA al 60 mM + βmercaptoetanol al 1% + la enzima Zymolysasa a una concentración final de 5 mg/mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US)], para romper la pared celular de la levadura, y se las incubó a 37°C por 2 hs. A continuación, se centrifugaron las células a 6000 rpm por 3 min, se extrajo el sobrenadante y se continuó la extracción del plásmido de la misma manera como se procede con bacterias (SECCIÓN 6.3.9). Una vez que el vector fue rescatado de las

células de levadura, se utilizó para transformar bacterias XL-Blue, tal como se detalla en la SECCIÓN

6.3.7, y, finalmente, la cantidad adecuada de vector purificado fue utilizada para transformar levaduras salvajes SEY6210, siguiendo el método del LiAc descripto más arriba.