En el cuadro 15 se presentan los resultados obtenidos para la prueba de McNemar, para evaluación de diferencias entre técnicas relacionadas. El principal hallazgo es que PCR no presentaría diferencias con ELISA IDBOM, INGE e IDPOUQ
Cuadro 15. Valor P de la prueba de McNemar, de las técnicas para el diagnóstico del Virus de la Leucosis Bovina; Inmunodifusión (ID), Reacción de polimerasa en cadena (PCR), ELISA IDEXX-Bommeli (IDBOM), ELISA INGENASA (INGE) y ELISA IDEXX-Pourquier (IDPOUQ) (α < 0,05 y 1 grado de libertad).
PCR IDBOM INGE IDPOUQ
ID 0,0044 0,0012 0,0000 0,0000
PCR 0,4310 0,4913 0,3887
IDBOM 0,0082 0,0015
6. DISCUSION
El objetivo de este estudio es evaluar el desempeño de 3 tipos de ELISA (indirecto, competencia y en leche) y PCR, principalmente frente al método de diagnóstico utilizado oficialmente en Chile. Adicionalmente, las pruebas de ELISA se compararon con PCR, por ser indicado como uno de los métodos de detección directa y como último punto, ver las variaciones que se presentan al formular un método de referencia, constituido por dos métodos diagnósticos (ID y PCR).
Los resultados obtenidos indican que, los ELISA evaluados mediante kappa, presentan una notable concordancia con inmunodifusión (cuadro 5), sensibilidades que oscilan entre un 89 y 100% y especificidades que oscilan entre 81 y 90% (Cuadro 2) y una eficiencia según J de Youden de 0,79 aproximadamente (cuadro 4). Estos resultados son comparables con los obtenidos por Felmer y col (2006); Monti (2005); Recabal (2005); Choi y col (2002); Gutiérrez y col 2001; Trono y col (2001); Simard y col (2000) y Molloy y col (1990), los cuales indican altos valores de sensibilidad y especificidad para los ELISA evaluados, la diferencia con ellos, radica en la magnitud de los valores. Nuestros resultados son mucho más mesurados, y en promedio obtienen valores de sensibilidad de 93% y una especificidad de 85% aproximadamente, mientras que ellos obtuvieron valores más cercanos al 100%. Esta variación se explica mayormente debido al número de positivos obtenidos por inmunodifusión en este estudio; al ser utilizado como referencia y al obtener un numero más bajo (cuadro 1) que el obtenido por el resto de pruebas, los valores de sensibilidad y especificidad se ven disminuidos, pero la tendencia indica que existe una correlación importante entre estas pruebas.
La variación en las capacidades diagnósticas de inmunodifusión y la determinada por los autores antes citados, podría deberse a la utilización de distintos procedimientos para realizar la prueba, ya que todos utilizaron métodos descritos y recomendados a partir de distintos kits. Por otra parte, cierto sesgo también es atribuible a la subjetividad con que se interpreta esta prueba, ya que depende en forma importante de la experiencia de quien la evalúa (OIE 2004; Nguyen y Maes 1993).
Otra posible explicación para estos resultados, consiste en la mayor sensibilidad descrita para las pruebas de ELISA. Simard y col (2000) indican que la dilución a partir de la cual ELISA indirecto es capaz de entregar resultados positivos, es de 1 es a 5000 frente a 1 es a 100 que presentaría inmunodifusión. Por lo cual podría ser que las muestras, no presentaran títulos de anticuerpos lo suficientemente elevados para dar un número mayor de muestras positivas a ID, pero si adecuadas, para los distintos ELISA. Esta variación en las concentraciones podría deberse también, a que utilizamos muestras compuestas por animales de distintos predios de la decima región, por lo cual, existe la posibilidad que se encuentren en distintos momentos de infección, (post infección, linfocitosis persistentes o
inmunosuprimidos), a diferencia de los estudios antes mencionados que utilizan generalmente animales de un mismo rebaño y generalmente con alta seroprevalencia. Por último, la OIE (2004) indica que entre 2 a 6 semanas antes del parto y entre 1 a 2 semanas post parto, existe movilización de anticuerpos séricos, hacia la glándula mamaria, por lo cual muchos resultados negativos otorgados por inmunodifusión, no son concluyentes y debiera repetirse, esta situación se condice también con lo antes expuesto, y agregaría otra fuente de discordancia entre pruebas.
Dentro de las pruebas evaluadas destaca el ELISA INGE, que obtiene los valores más altos en todos los indicadores estimados en este estudio. Este ELISA, es una prueba serológica del tipo de competencia, por lo cual es de esperar que presente un mejor desempeño en relación a las otras pruebas evaluadas, como lo confirman Monti 2005; Gutiérrez y col 2001 y Hoff-jorgensen 1989.
PCR es la prueba con más bajos índices de todas las pruebas evaluadas (inmunodifusión como referencia). Con una sensibilidad de 69,4%; especificidad de 79,6% (cuadro 2), eficiencia medida en J de Youden de 0,49 (cuadro 4) y un kappa de 0,45 (cuadro 5). La sensibilidad concuerda con los resultados obtenidos por Nagy y col (2003), pero difieren con los obtenidos por Felmer y col (2006) y Recabal (2005). Ambos autores describen a esta prueba con una alta sensibilidad (96%). Esta diferencia se explica por el número de positivos determinados por las pruebas. Al haber una cantidad de positivos similares entre las dos pruebas, se posibilita la obtención de niveles de sensibilidad más altos. Los resultados obtenidos por ambos autores podrían considerarse como adecuados a su estudio en cuestión, pero no serian del todo fiables, ya que para realizar la validación de pruebas diagnósticas, con niveles esperados de sensibilidad y especificidad de 90 %, nivel de confianza de 95 % y un error de 5 %, se requiere de al menos 138 animales (Greiner y Gardner 2000), cuando ellos consideraron solo 126. Por lo tanto, no alcanzaría el tamaño mínimo muestreal para dar mayor seguridad a sus resultados. Con Felmer y colaboradores (2006) se concuerda con el valor de kappa (0.45), este valor seria mas aplicable, ya que analiza la concordancia entre los resultados obtenidos entre las pruebas evaluadas. Si bien el PCR tiene una alta sensibilidad analítica, la OIE (2004) indica que PCR puede entregar resultados falsos positivos, debido a contaminación durante los procesos y falsos negativos por la presencia de sustancias inhibidoras, o a partir de muestras de sangre asociadas a bajos niveles de linfocitos periféricos infectados.
Cuando utilizamos a PCR como método de referencia, los resultados se modifican considerablemente. En la cuadro 6 se puede apreciar una importante caída en la sensibilidad de todas las pruebas evaluadas (inmunodifusión, ELISA IDBOM, INGE e IDPOUQ). Al ser evaluadas en comparación con inmunodifusión, la sensibilidad ronda el 93 % aproximadamente y cuando se comparan con PCR, el valor cae a un 62 % aproximadamente (para todos los ELISA). Inmunodifusión también presenta un valor de sensibilidad bajo (53,6 % cuadro 6). Por otra parte, la especificidad para todas las pruebas se mantiene semejante (82 % aproximadamente) y no difiere demasiado, de los resultados obtenidos cuando inmunodifusión era considerada como referencia (84% aproximadamente). Los resultados de este estudio se contraponen a lo publicado por Felmer y col (2006); Monti (2005); Recabal
(2005) y Gregory y col (2004). Describen una sensibilidad de 97% para ELISA indirecto, a excepción de Monti (2005) que encontró un valor de 89,3%. Felmer y col (2006) y Recabal (2005) describen también un 97% de sensibilidad para ELISA en leche, valores muy alejados a los calculados en este estudio.
Tanto los valores de sensibilidad como de especificidad, se ven afectados por el numero de positivos y negativos diagnosticados y a la concordancia que existe entre ellos. Es así por ejemplo, que al haber una cantidad mayor de positivos en la prueba de referencia, se posibilita que haya una mayor sensibilidad con la prueba evaluada y una mayor probabilidad de que coincidan los resultados. El nivel de eficiencia de esta prueba mediante J de Youden tiene un promedio aproximado de 0,42 y según kappa las pruebas se definirían como de moderada concordancia (cuadro 9). Existe un grado de acuerdo parcial con Felmer y col (2006) y Recabal (2005), ya que ambos autores obtuvieron un índice kappa de 0,45 para inmunodifusión, pero un valor de 0,85 para los ELISA indirecto y en leche. El mayor grado de concordancia entre ELISA y PCR, se podría atribuir, a que se trata de un rebaño con una prevalencia alta, lo que implica un aumento en la probabilidad de diagnosticar individuos positivos. Algunas razones que pueden explicar una menor cantidad de muestras diagnosticadas como positivas pueden ser: los partidores elegidos; de su elección depende altamente la sensibilidad, ya que los resultados de la elección de uno u otro, pueden verse afectados por las variaciones de las cadenas del virus (Marsolai y col 1994). Otra causa se atribuye, a que los linfocitos circulantes de animales seropositivos, hematológicamente normales y asintomáticos contiene de 1 a 3 copias provirales, mientras que el porcentaje de células infectadas por el virus es menor al 10 % (Mirsky y col 1996). Estos niveles pueden ser indetectables para PCR, pero ser lo suficientemente adecuados para inducir una respuesta inmune. En base a este último punto, Monti (2005) describe, que existe una tendencia a que las pruebas serológicas entreguen una gran cantidad de positivos y que varias de esas muestras den negativo para PCR.
Como comparación adicional en este estudio, se desarrolló una prueba de referencia combinada, basada en inmunodifusión y PCR. Esta referencia se elaboró en base a los siguientes requerimientos: individuo positivo, se considera aquel que se encuentre positivo en al menos una de las pruebas consideradas (ID y PCR) y negativo es aquel individuo que se encuentre negativo para ambas pruebas.
Los resultados obtenidos (cuadro 10), son similares a los arrojados por la comparación de las pruebas, con PCR como referencia. La sensibilidad de los ELISA fue en promedio aproximadamente de un 67,43 %; mientras que cuando se utilizó a PCR como referencia fue de un 62,75 aproximadamente. En relación a la especificidad, esta obtuvo valores elevados (88,79% aproximadamente), similares a los obtenidos, cuando se utilizó como referencia a inmunodifusión (86,05% aproximadamente). El valor J de Youden es de 0,55 aproximadamente (cuadro 12) y el valor de kappa indica una moderada concordancia entre ELISA y la prueba de referencia elaborada (cuadro 13).
Los resultados obtenidos se explican principalmente, por el criterio de formulación de la prueba de referencia. Los valores moderados de sensibilidad están supeditados a los
requisitos para la determinación de una muestra como positiva en relación a la prueba de referencia. Ya que para la formulación de la misma se consideró como positivo a cualquier individuo que fuera positivo, al menos a una de las dos pruebas incluidas en la referencia (ID y PCR), es así como el numero de muestras positivas en la referencia es mayor en relación a los ELISA evaluados, esto, porque en su formulación no solo se incluyen las muestras que son concordantes para inmunodifusión y PCR, sino que además se amplía este valor, por la inclusión de los valores positivos individuales para ambas pruebas. Es así, que al aumentar las muestras positivas como referencia, la sensibilidad disminuye producto de un aumento de falsos negativos al momento del tamizaje.
Para el caso de la especificidad, ocurre un caso distinto, el criterio de clasificación de las muestras como negativas, requería que para ello, ambas pruebas tuvieran resultados negativos (ID y PCR). Como resultado de esto, el número de muestras negativas disminuye, ya que solo considera aquellas en las cuales ambas pruebas concuerdan. Al disminuir este valor, se posibilita que exista una mayor concordancia con las pruebas de ELISA evaluadas, lo que a su vez aumenta el valor de la especificidad.
Es importante destacar, que según los resultados obtenidos en este estudio, inmunodifusión y PCR, son pruebas que no tienen una gran concordancia (evaluada según kappa), por lo tanto era de esperarse que los indicadores obtenidos apuntaran a que las pruebas de ELISA no tuvieran un gran desempeño.
Si bien este resultado es más que nada, una confirmación de los datos obtenidos, es relevante destacar, que estos índices son mejores, que los obtenidos por PCR, lo que indica que existe una mayor influencia de inmunodifusión en esta prueba de referencia elaborada, principalmente al momento de determinar las muestras consideradas como positivas.
Cuando evaluamos las pruebas de ELISA según la curva de ROC, y usando a inmunodifusión como referencia, podemos decir que en términos generales, todas las pruebas presentaron valores altos de área bajo la curva, por lo cual se considerarían como pruebas de gran utilidad para el diagnóstico de la enfermedad (rango 0,84 a 0,93 cuadro 14). Además se presentan variaciones entre los puntos de corte sugeridos por los fabricantes y los que podrían optimizar tanto la sensibilidad como la especificidad de las pruebas. Los nuevos puntos de corte para ELISA IDBOM e IDPOUQ, significan un incremento en la sensibilidad de 1,72 y de 0,53 % respectivamente, lo que en términos generales quiere decir que los puntos sugeridos y estimados son bastante similares para estas pruebas. No así para ELISA INGE, la variación de esta prueba corresponde a un 18%, con una sensibilidad estimada de 100% y una determinada por el punto de corte calculado de 82%. Esto indica que el punto de corte propuesto por el fabricante, no sería el óptimo bajo las condiciones de este estudio, ya que este valor estaría dando una cantidad menor de falsos negativos, lo que aumenta la sensibilidad de la prueba arbitrariamente. Estos resultados se contraponen a lo publicado en otros estudios, varios autores indican que los ELISA de competencia presentan una mayor sensibilidad que aquellos del tipo indirecto, por lo tanto, los resultados obtenidos inicialmente concordarían con lo publicado, pero no serian consistentes con los obtenidos en la evaluación de área bajo la curva y punto de corte (Monti 2005; Gutiérrez y col 2001; Hoff-jorgensen 1989).
Al usar PCR como referencia, ocurre una situación similar a cuando se utiliza a inmunodifusión como tal. Los ELISA IDBOM e IDPOUQ, presentan valores similares entre sí, las estimaciones indican que ambas pruebas deben modificar sus puntos de corte para así aumentar su sensibilidad y especificidad, ya que no estaría usando todo su potencial. Aunque basados en el área bajo la curva, las pruebas no presentaría una gran capacidad diagnóstica (rango 0,68 a 0,72 cuadro 13). Nuevamente ELISA INGE, presento ser la excepción, según la estimación, esta prueba estaría sobrevalorada y el nuevo punto de corte que optimizaría la prueba, le daría un muy discreto 25% de sensibilidad y un 63% de especificidad, por lo cual sus capacidades diagnósticas serian muy bajas, aun así, esta prueba presenta el área bajo la curva mayor de las 3 pruebas evaluadas.
La evaluación de las pruebas de ELISA, usando la combinación de los resultados de dos pruebas de referencia, mantiene la tendencia anterior. El área bajo la curva indica que todas las pruebas tienen un valor bajísimo para ser utilizadas como pruebas diagnósticas (rango 0,50 a 0,53 cuadro 14) y al punto de corte estimado la sensibilidad presenta un rango de 36 a 52% y la especificidad; 59 a 68 % (cuadro 14).
Del análisis de las curvas de ROC, podemos finalmente decir, que los resultados obtenidos, indican que, al tener una mayor similitud los ELISA con inmunodifusión, sus resultados las muestran como pruebas de gran utilidad diagnóstica, cosa que no sucede con PCR ni con la combinación de resultados de dos pruebas, que serian pruebas que se alejan tanto de inmunodifusión como con los ELISA evaluados.
Una vez concluido este estudio, podemos decir, que todas las distintas pruebas de ELISA evaluadas obtienen resultados similares, y guardan una buena concordancia con inmunodifusión. ELISA de tipo competitivo, presenta niveles de sensibilidad y especificidad, mayores que el resto de pruebas evaluadas.
Al ser PCR un método diagnóstico directo, su sensibilidad y especificidad, la ubican como un método de baja concordancia con el resto de pruebas evaluadas.
Los puntos de cortes proporcionados por los fabricantes de las distintas pruebas de ELISA evaluadas, se encuentran en un rango bastante similar, al óptimo recomendable para el país, esto siempre y cuando se les decida utilizar como pruebas alternativas a inmunodifusión, ya que al ser evaluadas con PCR, los puntos de corte obtenidos dañan considerablemente las cualidades diagnósticas de los ELISA evaluados.
Con respecto a la combinación de dos pruebas como referencia, podemos indicar, que su utilización estaría muy limitada, principalmente por el tiempo y costo que implica realizar PCR en forma conjunta con Inmunodifusión, en una masa de animales.
Como último punto, sería recomendable analizar las políticas de los programas de control y erradicación de la Leucosis viral bovina, ya que estudios previos y este, reafirman que las pruebas de ELISA constituye un métodos con buenos niveles de sensibilidad y
especificidad comparables a inmunodifusión, pero que además presenta un par de ventajas sobre la misma, como son su capacidad de aplicarse a una gran cantidad de animales, su costo relativo frente a las masas ganaderas que se evalúan, además de ser una prueba sencilla, rápida y que entrega resultados cuantitativos.
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