2.8. Theoretical Framework Development
2.8.1. Theoretical foundation of the study
calcio
De acuerdo al tipo de investigación por su diseño experimental y de laboratorio, su alcance comparativo y el método a nivel teórico con el uso de la modelación, se realiza una secuencia de procedimientos para la creación de un escenario adecuado para el desarrollo de la investigación y la obtención de datos reales, de tal manera que pueda ser comparado el nivel de efecto antimicrobiano de los dos medicamentos intraconducto propuestos en la presente investigación.
2.2.2.1. Elaboración de muestras experimentales
En la realización del presente ensayo in vitro inicialmente fueron escogidas 20 cajas petri de cultivos bacterianos de Enterococcus faecalis, por medio de los siguientes criterios.
Criterio de inclusión: Cultivos de bacterias Enterococcus faecalis que cumplan todos los requisitos de un medio ideal. Se utilizará Hidróxido de calcio químicamente puro de 10 gr y amoxicilina (20 ug) más ácido clavulánico (10 ug) en concentración de 30 ug cargados en discos para antibiograma. Criterio de exclusión: Cultivos que no cumplan los requerimientos normales como disponibilidad de nutrientes, consistencia adecuada del medio, condiciones adecuadas de humedad, luz ambiental, pH adecuado, Temperatura, Esterilidad.
Una vez seleccionadas las muestras, en cada una de ellas, se lleva a cabo los siguientes pasos organizados cronológicamente.
34 División de grupos de estudio
Las muestras fueron divididas en 2 grupos de estudio conformados por 20 cajas petri de cultivos bacterianos de Enterococcus Faecalis sometidas a las mismas condiciones, en las cuales se colocaran 2 discos de papel filtro con los diferentes sustancias antibacteriales, por lo que obtendremos 20 muestras para cada solución medicamentosa.
Obtención e Identificación de la cepa de Enterococcus faecalis
La cepa de Enterococcus faecalis fue proporcionada por el Instituto de Microbiología de la Universidad San Francisco de Quito, en Agosto del año 2016. A su vez, dicha cepa fue sometida a pruebas de identificación con bilis esculina, donde se certificó que corresponde a la especie y familia correcta.
Procesamiento de la cepa
La cepa de Enterococcus faecalis se sembró en el medio de cultivo BHI sólido en tubo a pico de flauta, siendo incubada por 24 horas, para luego ser transportada en medios adecuados de bioseguridad para su posterior almacenamiento en el Laboratorio de Especialidades Médicas Ochoa en el área de Microbiología.
Obtención de la muestra:
Se utilizó la cepa de Enterococcus faecalis.
Siembra de la cepa Enterococcus faecalis
Materiales utilizados: Asa estéril BHI líquido
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Hisopos estériles Mechero a gas
Caja petri con agar Mueller Hinton Escala de McFarland
Turbidímetro
Procedimiento:
Para ejecutar este procedimiento se empleó solución salina estéril en la misma que se agregó colonias de la bacteria Enterococcus faecalis sembrada en el agar nutritivo con la ayuda de una asa estéril, esta solución con colonias bacterianas se ajustó a una turbidez equivalente al estándar 0.5 de McFarland, al ser la turbidez adecuada se introdujó el hisopo estéril y se tomó una pequeña muestra de la colonia; se transfirió el inóculo a otro medio de cultivo estéril (agar Nutritivo de Mueller Hinton ya preparado) se retiró el exceso presionando en la pared interna del tubo que lo contiene; consecutivamente se procedió a inocular la superficie de la placa de agar misma que se realizó de la siguiente manera: la siembra se realizó en la parte media de la caja de la superficie de arriba a abajo y forma de zigzag de extremo a extremo, de manera continua para mantener la misma cantidad de bacterias y mejor distribución de las mismas en el medio de cultivo. Se dejó secar por 5 minutos. Y se incubó de forma invertida en grupos no superiores a 3 placas por 24 horas a 35°C.
Preparación y elaboración de los discos de hidróxido de calcio para antibiograma
Materiales utilizados:
Hidróxido de calcio químicamente puro (10 gr) Suero fisiológico
36 Espátula para cemento
Discos de papel filtro Procedimiento:
Se tomaron varias hojas de papel filtro las que se perforaron en discos de 5mm de diámetro con ayuda de una perforadora, fueron consecutivamente colocados en una caja petri de cristal para ser llevadas a la autoclave para su esterilización. Para la realización de todos los procedimientos a describir, se utilizó una cámara de bioseguridad que garantiza la esterilidad del área de trabajo y sustancias a emplear; una vez retirados los discos de papel filtro del autoclave, se preparó el hidróxido de calcio 99 % de pureza, en presentación comercial de frascos de 10 gr. (eufar línea dental), con suero fisiológico estéril, en el vaso dapen y se embebió los mismos dentro de esta sustancia, esperamos 5 min para que los discos se sequen dentro del ambiente estéril y poder utilizarlos en el antibiograma.
2.2.2.2. Evaluación de la susceptibilidad del Enterococcus faecalis frente a amoxicilina más ácido clavulánico versus hidróxido de calcio puro
Antibiograma de difusión en disco
Técnicas y fundamentos:
El microorganismo a investigar se inocula en una o varias placas de agar y sobre su superficie se disponen los discos correspondientes a las sustancias medicamentosas. Se incuban las placas de forma invertida en grupos no superiores a 3 durante 24 horas a 35ºC y al cabo de este tiempo se estudia el crecimiento en ellas. Se valora el diámetro de la zona de inhibición que se forma alrededor de cada disco. Con esta referencia podemos informar si el microorganismo es Sensible, Intermedio o Resistente (S, I, R) a cada uno de los medicamentos ensayados en las placas.
37 Asa estéril
Discos para antibiograma de hidróxido de calcio
Discos para antibiograma de amoxicilina más ácido clavulánico de 30 ug Estufa
Procedimiento:
Para la realización de todos los procedimientos se utilizó una cámara de bioseguridad que garantiza la esterilidad del área de trabajo al igual que el uso de un mechero el mismo que provee esterilidad al medio y sustancias de trabajo. Por lo que se colocó cada disco de amoxicilina más ácido clavulánico en concentración de 30 umg e hidróxido de calcio puro con una pinza estéril y con ligera presión sobre la superficie del agar de la caja Petri a 2mm del borde de la misma, para poder observar posteriormente los halos de inhibición, las placas se dejaron 15 minutos a temperatura ambiente para que se difunda el medicamento y se colocó las placas en la estufa por 24 horas a 350C.
Lectura de los halos de inhibición
Materiales utilizados: Regla milimetrada
Escala de diámetros de sensibilidad
Procedimiento:
Los halos de inhibición son zonas alrededor de un disco antibacteriano en un antibiograma en el que no se produce crecimiento bacteriano en una placa de agar inoculada con la bacteria. Es una medida de la potencia de la sustancia antibacteriana frente al microorganismo. Para este caso se realizó la medición en un tiempo de 24 horas de colocados los discos de papel filtro con la ayuda de una regla milimetrada sobre el reverso de la placa.
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2.3. Análisis e interpretación de Resultados de instrumentos aplicados