Para los 28 aislamientos de bacterias se realizó extracción de DNA y se amplifico la región 16S rDNA (Figura 6).
Figura 6. Amplificación por PCR de la subunidad pequeña del ribosoma 16S rDNA de los 28 aislamientos de bacterias obtenidos de Vaccinium sp. cv. Biloxy, con un tamaño de banda esperado de ~1500 bp. Muestras: DNA extraído de aislamientos de bacterias de: Tallo bajo 5, 7, 8, 12, 13, 15, 19, 21 y 24; Hoja baja 2, 4, 6, 14, 18 y 22; Hoja alta 3; Hoja media 11 y Raíz 1, 9, 10, 16, 20 y 25.
4.3 Amplificación de genes housekeeping para hongos
Para los 29 aislamientos de hongos se amplificaron genes housekeeping Actina, Quitin
sintasa, Glyceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, Histona 3, β-tubulina y Factor de
Figura 7. Amplificación por PCR de los genes multilocus (A) Actina, (B) Quitin Sintasa, (C) Glyceraldehido-3- fosfato, (D) Histona
3, (E) β- Tubulina y (F) Factor de elongación 1 α. De aislamientos de hongos obtenidos de plantas de Vaccinium sp. cv. Biloxy de 5
(A) (B)
(C) (D)
meses de edad sembradas en almacigo. Aislamientos de hongos de Tallo bajo 2-11,13, 15, Tallo medio17 y 18; Raíz 12,14. Hoja baja 1.
Cuadro 6. Relación de aislamientos de hongos aislados de Vaccinium sp. cv. Biloxy amplificados con cada uno de los genes housekeeping utilizados.
Aislamiento Genes
Identificación Parte de la planta
ITS Actina Quintin sintasa Glyceraldehido- 3-fosfato Histona 3 β - Tubulina Factor de elongación 1
9 Alternaria sp. Tallo bajo
17 Alternaria sp. Tallo medio
18 Alternaria sp. Hoja baja
21 Alternaria sp Raíz
23 Alternaria sp. Raíz
3 Alternaria sp. Tallo bajo
1 Alternaria sp. Hoja baja
25 Alternaria sp. Raíz
7 Sporotrix
varicecibatus
Tallo bajo
4 Alternaria sp. Tallo bajo
5 Alternaria sp. Tallo bajo
28 Alternaria sp. Hoja baja
13 Epicoccum nigrum Tallo bajo 24 Epicoccum sorghi (=Phoma sorghina) Tallo bajo
29 Epicoccum sorghi (=Phoma sorghina) Tallo bajo 6 Epicoccum sorghi (=Phoma sorghina) Tallo bajo
15 Geomyces sp. Tallo bajo
12 Ophiostomataceae Raíz
19 Ophiostomataceae Tallo medio
22 Trichoderma asperellum
Hoja alta
8 Hypocrea rufa Tallo bajo
14 Hypocrea rufa Raíz
Árbol filogenético basado en ITS (Espacio Interno Transcrito)
El árbol filogenético se construyó con secuencias de 550 bp de longitud obtenidas de la amplificación de la región del ITS. Se formaron dos clados generales. En el clado I estuvo conformado por dos subclados. En el subclado uno se agrupó todas las especies del género
Alternaria, no se observó diferenciación específica a nivel de especie, ya que no se
encuentran delimitadas en ramas terminales. El subclado dos se agruparon a las especies pertenecientes al género Epicoccum, en este subclado se observa una delimitación a nivel
de especie, ya que se puede observar dos grupos formados por Epicoccum nigrum y Epicoccum sorghi; cabe resaltar que los dos subclados que conforman el clado I,
corresponden a la fase asexual de Ascomycetos. El clado II se divide en dos subclados, donde e1 subclado uno se encuentran especies correspondientes al género Geomyces y a la
familia Ophiostomataceae, en este subclado se muestra que el conting H1 de un individuo
perteneciente al género Geomyces, es idéntico a la especie tipo con número de accesión en
GenBank D270630, de igual forma se observa que los individuos pertenecientes a la familia
Ophiostomataceae aislados de tallos se encuentra en una rama terminal y la especie tipo
con número de accesión en GenBank JQ272396 es diferente, ya que está en otra rama terminal. En el subclado dos, se agrupan individuos pertenecientes a los géneros Hypocrea
y Trichoderma, en este caso los individuos aislados en el presente estudio se encuentran
agrupados junto a las especies tipo de H. rufa, T. asperellum, T. atroviridae y T. koningii
(=Hypocrea koningii, estado sexual) observándose una clara delimitación a nivel de especie
4.4 Construcción de árboles filogenéticos
Figura 8. Árbol filogenético con inferencia bayesiana de 36 aislamientos. El árbol fue construido usando secuencias de ITS, con el programa Mr. BAYES. La desviación estándar final obtenida fue de 0.0042.
Árbol filogenético basado en el gen Beta-Tubulina
En el árbol filogenético construido con secuencias obtenidas de la amplificación del
gen β-tubulina, con un tamaño aproximado de 350 bp, en algunas muestras las hebras obtenidas por la secuenciación no fueron buenas, por lo tanto no se procesaron. Se pueden observar dos clados generales. El clado I está conformado por dos subclados. En el subclado uno se encuentra todas las especies pertenecientes al género Alternaria, no
observando una delimitación específica a nivel de especie. En el subclado dos se agrupan las especies pertenecientes al género Epicoccum y Phoma, en este subclado se
observa una mejor delimitación a nivel de especie, ya que agrupan los aislamientos B2 y B7 junto a la especie tipo con el número de accesión en Genbank FJ427174 Phoma sorghina , donde nos dice que los tres individuos pertenecen a la misma especie (Phoma sorghina); de igual forma nos agrupa en un clado a Epicoccum nigrum con Epicoccum
sp., pero ambos se encuentra en una rama terminal del mismo clado.
En el clado tres se encuentran las especies pertenecientes al género Fusarium y Sporothrix; donde se observa una buena delimitación a nivel de especie, ya que
concuerdan las ramas terminales con los individuos pertenecientes a cada especie, donde se observa la separación de género Fusarium y el género Sporothrix. El clado cuatro de
acuerdo al árbol filogenético tiene una menor relación a los tres clados mencionados anteriormente, debido a que se une a ellos en el nodo principal, en este clado se encuentran dos individuos de la especie Sporothrix variecibatus, uno de los individuos
accesión DQ821539, fue tomada como especie de referencia, lo cual habría que rectificar si la identificación molecular es correcta (Figura 9).
Figura 9. Árbol filogenético con inferencia bayesiana de 36 aislamientos. El árbol fue construido usando secuencias de β-TUB con el programa Mr. BAYES., la desviación estándar final obtenida fue de 0.005.
Árbol filogenético basado en el gen Glyceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa
El árbol filogenético se construyó con secuencias de 150 bp aproximadamente de longitud, obtenidas de la amplificación del gen glyceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa. En algunas muestras las hebras obtenidas por la secuenciación no fueron buenas, por lo tanto no se procesaron. En este árbol filogenético se delimitan dos clados. En el clado uno se encuentran todas las especies pertenecientes al género Alternaria; este clado
puede dividirse en dos subclados. En el subclado (a) están agrupados todos los individuos que no se sabe a qué especie de Alternaria corresponden. En el sublaclado (b)
se encuentran agrupados todos los individuos pertenecientes a diferentes especies del genero Alternaria, a excepción del conting G7 y la especie tipo JX960575, donde
observamos que la especie tipo Alternaria brassicicola es la menos parecida a todas las
demás especies de este género, ya que se encuentra en una rama terminal.
El clado dos se encuentra formado por dos individuos del género Trichoderma,
donde probablemente el conting G sea una especie diferente a Trichoderma atroviride,
Figura 10. Árbol filogenético con inferencia bayesiana de 36 aislamientos. El árbol fue construido usando secuencias de Glyceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, con el programa Mr. BAYES. la desviación estándar final obtenida fue de 0.005
Árbol filogenético basado en el gen Factor de elongación 1
El árbol filogenético se construyó con secuencias de 350 bp de longitud obtenidas de la amplificación del gen, en algunas muestras las hebras obtenidas por la secuenciación no fueron buenas, por lo tanto no se procesaron. En el árbol se generó un solo clado. En el clado I se puede observar cinco subclados. En el subclado uno se encuentran agrupados todos los individuos pertenecientes a las especies al género Alternaria y se observa que no
hay una delimitación a nivel de especie, ya que todas están agrupadas en una misma rama. En el subclado dos se encuentran agrupados tres individuos del genero Pseudogymnoascus
(fase sexual del género Geomyces), identificado con ITS en el presente estudio, observando
que en este subclado hay una buena delimitación a nivel de especie.
En el subclado tres se encuentran tres individuos de dos especies diferentes del género
Leptosphaerulina. En el subclado cuatro se encuentran cuatro individuos del género Cladosporium, los cuales fueron aislados de tallos de V. corymbosum del presente estudio,
donde probablemente se traten de dos especies diferentes de acuerdo a las ramas terminales. En el subclado cinco se encuentran individuos de especies pertenecientes al género
Hypocrea y Fusarium, donde también se muestra una buena delimitación a nivel de especie
de ambos géneros; ya que Fusarium equiseti se encuentra en una rama terminal; tres
individuos de la especie Hypocrea rufa se encuentran en una rama terminal, difiriendo de Hypocrea koningii (Figura 11).
Figura 11. Árbol filogenético con inferencia bayesiana de 36 aislamientos. El árbol fue construido usando secuencias de Factor de elongación 1 α, con el programa Mr. BAYES. la desviación estándar final obtenida fue de 0.0068
Árbol filogenético basado en el gen Histona 3
El árbol filogenético se construyó con secuencias de 450 bp longitud, obtenidas de la amplificación del gen Histona 3. En algunas muestras las hebras obtenidas por la secuenciación no fueron buenas, por lo tanto no se procesaron. Se generaron dos clados, el clado I está dividido en dos subclados. En el subclado uno se encuentran agrupados todos los individuos pertenecientes a las diferentes especies encontradas del genero Alternaria, donde se ve una clara delimitación de las especies. En el subclado dos se
encuentran agrupados los individuos de las especies pertenecientes al género Fusarium,
donde se observa que la especie de Fusarium campotoceras es la menos parecida entre
los tres individuos de Fusarium.
En el clado tres se encuentran tres individuos pertenecientes a las especies del genero
Cladosporium, el cual tiene una buena delimitación de las especies, ya que cada una se
encuentra en una rama terminal.
El clado II se divide en dos subclados. En el subclado uno, están agrupados dos individuos pertenecientes al género Phoma y Cladosporium, donde se observa una
buena delimitación a nivel de género y especie. El subclado dos se encuentra conformado por dos individuos, un individuo perteneciente al género Hypocrea aislado en el presente estudio, ubicado en una rama terminal, lo que nos indica que se trata de una especie diferente a la especie tipo con número de accesión en GenBank AF520775
Figura 12. Árbol filogenético con inferencia bayesiana de 36 aislamientos. El árbol fue construido usando secuencias de Histona 3, con el programa Mr. BAYES. la desviación estándar final obtenida fue de 0.0040.
Multilocus
El árbol filogenético construido con el análisis multilocus, obtenido con base al Teorema de Bayes, se construyó con secuencias obtenidas de la amplificación de los genes de Beta-Tubulina, Glyceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, Factor de elongación 1, Histona 3, Actina; y la región del Espacio Transcrito Interno. Se generó un árbol filogenético, en el que se pueden definir dos clados.
En el clado I, se observan dos subclados. En el subclado uno se agrupan las especies del genero Alternaria. En el subclado dos están bien delimitados todos los individuos de las
especies del género Epicoccum. En el clado II, se pueden observar tres subclados. En el
subclado uno, se observa que el conting H1 aislado en el presente estudio de tallos de
Vaccinium sp. cv.Biloxy. corymbosum perteneciente al género Geomyces, y la especie tipo
con número de accesión en GenBank JX270600, donde probablemente se trata de dos especies diferentes ya que cada una se encuentra en una rama terminal del subclado. El subclado dos se encuentran tres individuos del genero Ophiostomataceae.
En el subclado tres se encuentran individuos de especies del género Trichoderma e Hypocrea, donde se observa una delimitación clara de las especies, ya que corresponden a
Figura 13. Árbol filogenético con inferencia bayesiana de 36 aislamientos. El árbol fue construido usando secuencias concatenadas de Actina, β-Tubulina, Histona 3, Quitin sintasa, Glyceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, Factor de elongación 1 e ITS, con el programa Mr. BAYES. la desviación estándar final obtenida fue de 0.006
Árbol filogenético basado en el gen 16S rRNA
El árbol filogenético, se construyó con secuencias de 1500 bp, obtenidas de la amplificación del gen 16s rRNA. En algunas muestras las hebras obtenidas por la secuenciación no fueron buenas, por lo tanto no se procesaron. Se observan cuatro clados. El clado I, está dividido en dos subclados; donde se definen dos agrupamientos. En el agrupamiento uno se encuentran todos los individuos pertenecientes al género
Burkholderia, y en el segundo agrupamiento se encuentran dos individuos pertenecientes
al género Delfia, observando que podrían ser la misma especie, ya que ambos se
encuentran en una rama terminal. En el subclado dos, se encuentran todos los individuos pertenecientes al género Pantoea, no observando una buena delimitación a nivel de
especie en este agrupamiento.
En el clado II, se encuentran agrupados todos los individuos pertenecientes al género
Pseudomonas, no observando una buena delimitación a nivel de especie. El clado III, se
observan dos agrupamientos. El primer agrupamiento se encuentran individuos pertenecientes al género Sphingomonas, observando una buena delimitación en el
agrupamiento a nivel de especie. En el agrupamiento número dos, se observan tres individuos pertenecientes al género Novosphingobium, observando una buena
delimitación a nivel de especie. El clado IV, se observan dos agrupamientos. El agrupamiento uno se encuentran individuos pertenecientes al género Leifsonia,
observando una buena delimitación a nivel de especie. En el segundo agrupamiento, se encuentran los organismos pertenecientes al género Curtubacterium, no observando una
Figura 14. Árbol filogenético con inferencia bayesiana de 26 aislamientos de bacterias. El árbol fue construido usando secuencias del gen 16s rRNA, con el programa Mr. BAYES. la desviación estándar final obtenida fue de 0.004
De cada una de las regiones consideradas se obtuvo información básica sobre niveles de variación nucleotídica, (i) sitios conservados, (ii) sitios variables, (iii) sitios informativos en parsimonia y (iv) singletones, implementados en el programa MEGA 6 (Tamura et al. 2013).
Cuadro 7. Variación de los genes, Actina, Quintin sintasa, Glyceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, Histona 3, β-Tubulina, Factor
de elongación 1α y Espacio Interno Transcrito en hongos aislados de Vaccinium sp. cv. Biloxy.
Regiones analizadas Secuencias analizadas Sitios obtenidos Sitios analizados Sitios conservados Sitios variables Sitios informativos Singletones Actina (ACT) 15 335 324 98 226 190 36 Quitin sintasa (CHS-1) 10 353 298 162 83 58 25 Glyceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) 12 178 139 56 81 0 81 Histona3 (HIS3) 16 480 414 276 130 54 67 Beta-tubulina (TUB2) 15 405 354 92 249 103 142
Factor de elongación 1 (TEF) 22 369 309 224 82 50 32
Espacio Transcrito Interno (ITS)
Cuadro 8. Variación del gen 16S rRNA en bacterias aisladas de Vaccinium sp. cv Biloxy Regiones analizadas Secuencias analizadas Sitios obtenidos Sitios analizados Sitios conservados Sitios variables Sitios informativos Singletones 16S 26 1500 1408 708 596 460 89
V. DISCUSIÓN
El arándano junto con la fresa y zarzamora es una de las frutillas cuyo cultivo actualmente se está extendiendo en México, el cual se ve reflejado por el incremento anual de la superficie sembrada en el centro occidente del país (SIAP, 2013).
Considerando que el arándano es un cultivo de introducción, los sistemas de producción se han visto alterados por la presencia de enfermedades que reducen el rendimiento y la calidad de la frutilla para comercialización.
La producción de arándano inicia con la adaptación de plántulas in vitro en viveros.
De las muestras obtenidas de plantas in vitro que se sembraron en medios de cultivo no
se obtuvo algún crecimiento de hongo o bacteria, por lo que con base en los análisis realizados, se presume que las plantas in vitro obtenidas de este vivero podrían estar
libres de microorganismos cultivables (hongos y bacterias). Caso contrario son las plantas derivadas de cultivo in vitro, y propagadas en almácigo, ya que de ellas si se
obtuvieron hongos y bacterias. Por lo tanto un probable foco de contaminación sea en el momento del trasplante de la planta al sustrato para la aclimatación, o durante el desarrollo de la misma en las áreas de crecimiento o por el uso de sustratos contaminados.
Las especies de hongos identificadas en el presente estudio mediante aproximaciones filogenéticas y análisis bioinformáticos de 5 locus fueron: Alternaria spp., la cual fue
síntomas en ramas y tallos al ser recién trasplantadas en campos comerciales (Wright et al., 2004). Los síntomas observados en tallos, coinciden con los reportados.
Epicoccum sorghi (=Phoma sorghina) y Epicoccum nigrum, estas dos especies
fueron reportadas causando enfermedad en Estados Unidos de América (Massachusetts y Michigan). Al igual que Cladosporium sp., reportada en Massachusetts; las tres
especies causando daño en tallos (Zuckerman, 1960; Weingartner and Klos, 1974). Al igual estas especies estuvieron presentes en aislamientos de tallos bajos y medios.
Otras especies de hongos encontradas, pero no reportadas causando enfermedad en Vaccinium sp. cv. Biloxy fueron: Trichoderma sp., Geomyces sp., Leptosphaerulina
sp. y Sporothrix variecibatus.
Los cinco regiones moleculares seleccionadas en este estudio se amplificaron los 29 aislamientos de hongos aislados de V. corymbosum. De estos loci, ITS fue la región que
presentó la más alta calidad en lectura y alineamiento de las secuencias, seguida por TEF
y β- Tubulina. Las regiones que mostraron mayor dificultad en el alineamiento en comparación con ITS fueron CHS-1 y GAPDH, debido a que los genes multilocus no son genes utilizados de manera universal o de manera general para todos los microorganismos
Los árboles que mostraron un mejor arreglo fue el realizado con ITS, por lo cual es el más usado en la identificación filogenética. El árbol filogenético que genero mayor diferenciación a nivel de especies fue el realizado con el análisis multilocus, ya que en
este análisis se obtuvo mayor información del genoma de cada individuo y por lo tanto una mayor discriminación (Figura 13).
Todos estos microorganismos encontrados en el presente estudio, están asociados a la planta como parásitos pudiendo o no causar un proceso de patogénesis. Este conocimiento será de utilidad para los productores de plántulas en vivero en el cual la calidad fitosanitaria del material utilizado para propagación debería estar libre de posibles patógenos que en condiciones ambientales favorables puedan iniciar una epidemia y dispersar la enfermedad en zonas donde han estado ausente o mantenerse de manera asintomática para trasmitirse de una generación a otra.
VI. CONCLUSIONES
Los microorganismos asociados a material propagativo de arándano proveniente de un vivero del estado de Michoacán pertenecen a las especies Alternaria sp., Epicoccum nigrum, Epicoccum sorghi, Geomyces sp., Trichoderma sp., Hypocrea rufa, Sporotrix variecibatus, Pantoea sp., Pseudomonas sp., Curtobacterium sp, Burkholderia sp., Delfia sp. Sphingomonas sp, Novosphingobium sp. y Leifsonia sp. asociados a raíz, tallo
y hojas En cuanto a los análisis moleculares para la identificación filogenética de las especies utilizar otro gen para poder distinguir entre las especies del género Alternaria.
Además de obtener la secuencia completa del gen 16s rRNA para Pseudomonas sp. y
utilizar iniciadores específicos con el fin de precisar si es una nueva especie o al grupo de Pseudomonas in sensu stricto a la que pertenece el aislamiento.
No se presentó crecimiento de microorganismos asociados a plántulas in vitro.
Esterilizar el substrato en el cual son colocadas las plántulas en el vivero, ya que puede ser una fuente de contaminación en la planta, antes de ser llevadas a campo. Verificar el proceso de producción de material vegetal.