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INTRODUCCIÓN

La epigenética describe los cambios heredables en la función génica que se producen independientemente de la secuencia de ADN. Un marca epigenética relevante en células de mamíferos es la metilación de ADN en dinucleótidos CpG que participa en la regulación de la expresión génica de dos formas, directamente al impedir la unión de factores de transcripción, e indirectamente propiciando la estructura cerrada (1-5). Los genomas de las células preneoplásicas, cancerosas y envejecidas comparten tres cambios importantes en los niveles de metilación primero, la hipometilación de la heterocromatina que conduce a una inestabilidad genómica e incrementa los eventos de recombinación mitótica; segundo, hipermetilación de genes individuales y, finalmente hipermetilación de la islas CpG de genes constitutivos y genes tumor supresor (1, 3, 6). Es así como, la hipermetilación está involucrada con el silenciamiento de genes y la hipometilación con la sobre–expresión de ciertas proteínas involucradas en los procesos de invasión y metástasis (7).

El conocimiento de las modificaciones epigenéticas que ocurren en las enfermedades humanas será importante para su manejo futuro, dado que podrá contribuir a la comprensión de la patogénesis de la enfermedad e identificar posibles biomarcadores epigenéticos (5, 8, 9). Estudios moleculares han demostrado que alteraciones epigenéticas como la metilación anormal en sitios de transcripción génica puede dar como resultado un silenciamiento epigenético de genes específicos afectando su función y dando como resultado el desarrollo de enfermedades complejas como el cáncer (10). La metilación de ADN no solo está presente en las fases tempranas de la carcinogénesis, también es común en lesiones avanzadas del cáncer (10). La carcinogénesis gástrica es un proceso multifactorial iniciado por la infección por H. pylori y caracterizado por alteraciones genéticas y epigenéticas involucrando genes supresores de tumor, protooncogenes, genes reguladores del ciclo celular, genes relacionados a invasión o de reparación. Actualmente, se han descrito que mecanismos genéticos y epigenéticos, están implicados con dichos cambios moleculares. La diferencia entre ambos mecanismos se encuentra en que las alteraciones epigenéticas son potencialmente reversibles con la eliminación del agente infeccioso. El CG se caracteriza por ser uno de los tumores con una alta frecuencia de metilación de islas CpG (11).

Las vías celulares afectadas en el proceso carcinogénico incluye vías como ciclo celular, reparación de ADN, apoptosis, respuesta hormonal, invasión celular y metástasis. En relación al ciclo celular, genes como p16 INK4a, CDKN2B/p15 y p14ARF 1 (12, 13) se encuentran hipermetilados en líneas celulares humanas y tumores primarios. En el caso de p21WAFI se encuentra asociado a extensiva

acetilación de histonas (14). MLH1 se encuentra hipermetilado en cáncer de seno (15). MGMT se encuentra hipermetilado en varios tipos de cancer (16). Respecto a genes relacionados con respuesta hormonal y factores de crecimiento, genes como TGF-B se encuentra con modificación de histonas en células de cáncer de seno (17). IGFBP1 se encuentra hipermetilado en cáncer renal. En cuanto a genes relacionados con angiogénesis y adhesión celular, APC, caderina E - CDH1, caderina H - CDH13 y la caderina supresor de tumor - FAT, se encuentran hipermetilados en varios tipos de cáncer (18).

En el presente estudio se logró caracterizar el perfil de metilación de genes relacionados con inflamación, angiogénesis, reparación de ADN y ciclo celular en la carcinogénesis gástrica, siendo este el primer estudio en pacientes con lesiones gástricas preneoplasicas y CG en una población del departamento del Cauca.

MATERIALES Y MÉTODOS Diseño de estudio y población

Es un estudio de tipo descriptivo, transversal de serie de casos que fue realizado en individuos caucanos que asistieron a los principales servicios de consulta de gastroenterología de la ciudad de Popayán. Un total de 500 de los 1.019 pacientes que ingresaron al estudio fueron seleccionados cumpliendo los criterios de inclusión y exclusión previamente descritos en el documento para realizar las pruebas moleculares. Dado el alto porcentaje de infección por H. pylori y la baja frecuencia de variables de estudio para comparación entre los diferentes estadios clínicos se realizan los análisis estadísticos en población infectada. Todos los procedimientos se realizaron en cumplimiento según principios ética ya descritos (19, 20). (Figura 13)

Identificación de Genes

Para la identificación de los genes asociados con la enfermedad y metilación, se realizó una búsqueda electrónica mediante revisión sistemática en la base de datos del NCBI- PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) teniendo en cuenta artículos publicados entre el 1 de enero 2011 hasta el 1 de mayo del 2015. Se emplearon artículos de (meta- análisis, revisión y estudios de asociación). En la tabla 23 se indica la descripción de genes analizados para determinar el perfil de metilación en la población de estudio.

Tabla 23. Lista de genes analizados para metilación.

GENES POSICIÓN GENOMA REGIÓN PROMOTOR REGIÓN ANÁLISIS TAMAÑO DEL FRAGMENTO FUNCIÓN IL6 7p21 22762266 - 22766765 2840-3440 522 Inflamación IL8 4q13 74601723-74606222 1370-1970 450 Inflamación IL10 1q31 206945840- 206950339 1600-2200 418 Inflamación TGF-B1 19q13 41859832-41864331 3593-4193 500 Inflamación MIF 22q11 24232065-24236564 3900-4500 426 Inflamación VEGFA 6p12 43733446-43737945 3850-4450 584 Angiogénesis MLH1 3p21 37030341-37034840 3860-4460 612 Reparación de ADN RUNX3 1p36 37030341-37034840 2538-3138 574 Factor de transcripción P16 (CDKN2A) 9p21 21975133 - 21979632 (-) 2869-3469 642 Ciclo cellular

Extracción de ADN Humano

El ADN se extrajo de muestras de biopsias gástricas utilizando el procedimiento de Salting Out descrito por Miller et al (21) a una concentración de ADN por 30 ng / dL, cuantificado con un espectrofotómetro NanoDrop 2000c.

Extracción de ADN bacteriano a partir de biopsia gástrica y detección de infección con H. pylori.

El ADN bacteriano fue obtenido de muestras de tejido gástrico de cada sujeto incluido en el estudio mediante el uso del kit de extracción de ADN Wizard Genomic DNA Purification Kit® (Promega, Madison, WI, USA), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Todo el procedimiento esta previamente descrito en el documento.

Análisis de metilación

La metilación de ADN por la tecnología EpiTYPER (Sequenon) permite de manera precisa, rápida interrogar varios sitios CpG y detectar hasta un 5% de las diferencias en la metilación. Este método inicia con el tratamiento del ADN genómico con bisulfito sódico que se realizó con el Kit de metilación EZ-96 DNA (http://zymoresearch.com). Posteriormente, se pasa a la amplificación por PCR de las regiones de destino utilizando cebadores con una etiqueta del promotor T7. A continuación, se lleva a cabo la transcripción in vitro del ARN, seguido por una escisión base-específica del ARN. Por último, los productos de escisión se analizaron usando espectrometría de masas MALDI-TOF (MassARRAY Analyzer). Los residuos de citosina metilados y no metilados en el ADN genómico original, se distinguen fácilmente usando EpiTYPER Software. Este software minimiza el diseño manual y la optimización de ensayo (22).

Primers: El diseño de los primers fue a partir de las secuencias dadas usando EpiDesigner (www.epidesigner.com)

Tratamiento con Bisulfito: El tratamiento de conversión de bisulfito se realizó con el Kit de metilación EZ-96 DNA (http://zymoresearch.com). Posteriormente se realizó la incubación con los siguientes ciclos:

45 ciclos: 95º C por 30 minutos 50º C por 15 minutos

Paso Amplificación: Se usó 1 ul de ADN (10ng/Ul) para concentración final de 2ng/uL por reacción.

Sellado de placas y ciclos:

 94º C por 15 minutos

 45 ciclos: 94º C por 20 segundos

 56º C por 30 segundos

 72º C por un minuto

 72º C por 3 minutos

Paso defosforilación: Se adicionó 2 uL de Fosfatasa Alcalina (SAP) para desfosforilar dNTPs no incorporados de la PCR. Se incubó a 85º C por 5 minutos.

Paso Clevaje: Se preparó cocktail transcripción/RNasa (5 ul) y se incubó los platos a 37º C por tres horas.

Paso acondicionamiento: Se adicionó 20 ul de ddH20 a cada muestra y vortex por 5 min a 3.200 g.

Paso transferencia de la muestra: Se dispensó 10-15 nl de la reacción del producto EPITYPER dentro del SpectroCHIP

Paso final: El análisis de muestras se adquiere mediante el sistema MassARRAY y los resultados fueron analizados en software EpiTYPER.

Figura 14. Método de metilación con Sistema EpiTYPER

Análisis estadístico

Los datos fueron analizados mediante el paquete estadístico SPSS versión 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Las variables continuas fueron expresadas usando la media y la desviación estándar y la prueba de ANOVA se usó para comparar medias entre los diferentes grupos con la prueba poshoc de Bonferroni.

RESULTADOS

En la figura 15 se muestra un ensayo de optimización de primer que se realizó para cada uno de los genes de estudio. La figura 16 indica una representación gráfica de los sitios CpG con el amplicon seleccionado. Cada una está codificada por un color según el grado de metilación como muestra el panel del epigrama (0% no metilado - 100% metilado), se muestra un ejemplo del gen MIF en diferentes casos siendo ≤ 10% de metilación.

En la tabla 24 se indican los resultados de frecuencia de metilación en población H. pylori (+) que corresponde al 78% de la población de estudio en las diferentes lesiones gástricas y CG los cuales mostraron baja frecuencia de metilación (≤10%) en los diferentes estadios para los genes MIF y VEGFA. Un porcentaje entre 38%-41% sin diferencia significativa en todos los estadios enfermedad para IL10. Para el genTGFB1 se reportó una frecuencia de metilación entre 60%-68% sin encontrar una diferencia significativa. El gen IL8 reportó una frecuencia de metilación entre 84%-85% sin diferencia significativa. Los genes MLH1, RUNX3 y p16 indicaron una diferencia significativa importante (p= 0,002, 0,031 y 0,013 respectivamente). Según las correcciones de bonferroni, para el caso del gen MLH1 la DG mostró una diferencia significativa en comparación a las otras lesiones gástricas (GCNA – DG: 0,006: GCA- DG: 0,012; MI- DG: 0,001 y CG-DG: 0,06). Para el gen RUNX3, la diferencia significativa se corroboró entre GCA – MI p= 0,005). Y para el gen p16, la diferencia fue significativa entre GCA-CG (p=0,029). Posteriormente, se analizó el perfil de metilación comparando el grupo de individuos con lesiones gástricas preneoplásicas con el grupo de CG, encontrando que el gen que mostró una diferencia significativa fue p16 (p= 0,001) con un promedio de metilación de 35,37 ± 9,80 comparado a 42,16 ± 14,15 en CG (Tabla25).

Figura 15. Ensayos de optimización de primers. Verificación de primer con escalera 1 kb (Invitrogen). Análisis de optimización de primers del pull de genes de estudio a diferentes temperaturas (560, 680 y 600)

Figura 16. Modelo Perfil de epigrama para MIF. Ejemplo del gen MIF en diferentes casos clínicos siendo ≤ 10% de metilación, representada en el color lila oscuro. La escala de medición es de 0% no metilado - 100% metilado (color amarillo)

Tabla 24. Perfil de metilación en lesiones gástricas en población H. positiva (cagA (-)/vacAs1m1). Gen GCNA Media ± DE GCA Media ± DE MI Media ± DE DG Media ± DE CG Media ± DE p MIF 7,40 ± 3,91 7,80 ± 3,47 7,69 ± 3,52 6,76 ± 1,92 7,89 ± 3,57 0,755 MLH1 10,21 ± 4,24 10,50 ± 5,62 8,98 ± 4,40 19,0 ± 16,11 8,80 ± 3,88 0,002 TGFB1 62,11 ± 11,90 59,46 ± 14,42 59,48 ± 11,87 68,50 ± 12,02 63,25 ± 7,90 0,164 RUNX3 34,75 ± 13,95 32,90 ± 12,80 37,89 ± 12,93 39,56 ± 9,49 38,07 ± 12,03 0,031 IL10 41,80 ± 17,54 36,30 ± 17,83 41,77 ± 17,35 39,15 ± 18,20 38,51 ± 15,07 0,342 IL6 42,49 ± 17,05 39,53 ± 19,14 34,65 ± 15,85 28,86 ± 15,11 32,59 ± 16,93 0,401 CDKN2A 35,22 ± 9,94 35,10 ± 10,32 35,26 ± 9,42 37,93 ± 10,55 42,16 ± 14,15 0,013 IL8 84,82 ± 7,45 84,32 ± 6,75 84,19 ± 7,80 84,28 ± 6,38 83,96 ± 7,74 0,942 VEGFA 5,43 ± 3,39 5,51 ± 3,05 5,13 ± 3,11 6,25 ± 4,05 4,64 ± 2,54 0,484

T students para promedios. Nivel de significancia p ≤ 0,05; DE: Desviación Estandar; GCNA: Gastritis Crónica No Atrófica, GCA: Gastritis Crónica Atrófica, MI: Metaplasia Intestinal, DG: Displasia, CG: Cáncer Gástrico

Tabla 25. Perfil de metilación en lesiones gástricas en relación a cáncer gástrico (H. positiva +). Gen LP Media ± DE CG Media ± DE p MIF 7,56 ± 3,59 8,44 ± 5,16 0,584 MLH1 10,23 ± 6,08 10,75 ± 4,85 0,469 TGFB1 60,75 ± 12,46 66,38 ± 4,74 0,339 RUNX3 35,87 ± 13,27 41,0 ± 13,72 0,287 IL10 40,69 ± 17,57 38,60 ± 12,74 0,463 IL6 38,07 ± 17,38 44,40 ± 22,28 0,215 CDKN2A 35,37 ± 9,80 42,16 ± 14,15 0,001 IL8 84,45 ± 7,39 83,96 ± 7,74 0,068 VEGFA 5,37 ± 3,33 4,64 ± 2,45 0,208 LP: Lesiones gástricas preneoplásicas. CG: Cáncer Gástrico. DE: Desviación estándar. Nivel de significancia p ≤ 0,005

DISCUSIÓN

El estudio de los procesos epigenéticos en el desarrollo del cáncer es clara, dado que puede contribuir a formular nuevos biomarcadores y estrategias en salud. Alteraciones en la metilación de ADN, modificación de histonas, remodelación de la cromatina y patrones de microRNAs son las principales alteraciones epigenéticas asociadas a carcinogénesis (12). Las alteraciones en los patrones de metilación normales se han evidenciado como una característica intrínseca del desarrollo tumoral en todos los tipos de cáncer analizados, afectando varias rutas de señalización (23). Muchos de los genes afectados reportados son genes supresores de tumor Involucrados en regulación de ciclo celular, reparación de ADN, apoptosis, angiogénesis, invasión y adhesión (12). En cáncer, las lesiones precursoras de tumores presentan alteraciones de la expresión debidas a cambios en los perfiles epigenéticos. Los patrones de metilación de ADN cambian drásticamente generando reprogramación del epigenoma y alterando los patrones de expresión. Se genera dos alteraciones epigenéticas la hipermetilación de genes supresores de tumor y la hipometilación global del ADN que afecta secuencias repetitivas en dominios de heterocromatina y elementos transponibles en integrados en el genoma (24).

El estómago es uno el órgano donde más frecuentemente sucede metilación de islas CpG en células epiteliales. La principal causa no está aún clara pero podría estar relacionada al fácil acceso del tejido a agentes exógenos. Adicionalmente, la mucosa gástrica puede producir materiales endógenos como especies reactivas de oxígeno (ROS) y óxido nítrico (NO), el cual causa metilación de las islas CpG (25). El CG es uno de los tumores con alta frecuencia de metilación en varios genes y el número de genes metilados se incrementa durante el proceso de la carconogéneis gástrica (26). Una causa relevante en la inducción de alteraciones epigenéticas puede estar asociada a la presencia del principal agente etiológico H. pylori. Se conoce que H. pylori infecta el estómago humano, induce una respuesta inflamatoria que incluye úlcera, inflamación crónica y finalmente CG al paso de 10 años. Varias investigaciones han discutido los mecanismos carcinogénicos de H. pylori induciendo proliferación celular, mutaciones y activación directa de señalización celular 1 (27-29). Sin embargo, genes como CDKN2A, CDH1, MLH1 y RUNX3, son inactivados frecuentemente por metilación anormal de ADN, lo cual indica que el CG es una enfermedad epigenética (30).

Los cambios epigenéticos representan cambios importantes en la expresión de los genes, especialmente cuando aparecen enfermedads crónicas. Perfiles de metilación en una lista de genes fueron reportados en este estudio. El presente estudio no encontró diferencias entre los estados de metilación del gen MIF y las lesiones preneoplásicas y cáncer gástrico de pacientes infectados con H. pylori. Son pocos los estudios del estado de metilación en el gen MIF en cáncer gástrico, sin embargo, se ha reportado que el polimorfismo -173G>C está asociado con el estado metilación en islas CpG en la región

promotora del gen MIF en la mucosa gástrica y al mismo tiempo puede estar relacionada con la carcinogénesis (31).

Mecanismos epigenéticos relacionados con la metilación del promotor de hMLH1 se han implicado en el desarrollo de cáncer gástrico. Los resultados muestran mayor porcentaje de metiliación del gen MLH-1 en personas con DG y H. pylori positivos. En relación a otros a estudios, se ha reportado que metilación del gen MLH1 está estrechamente asociado con un pobre pronóstico de pacientes con cáncer gástrico (32). Otros estudios han reportado que la hipermetilación del gen MLH1 estuvo fuertemente relacionado con la ausencia de la expresión de la proteína (CpG Island Methylation in Premalignant Stages of Gastric Carcinoma), un mecanismo de inactivación presente en CG (33, 34). Estudios han demostrado que la proteína codificada por TGF-β1 funciona como un supresor de tumores, al inhibir potentemente la proliferación de muchos tipos de células cancerosas y el silenciamiento del gen asociado a la metilación implicado en el desarrollo de tumores (35). En la población analizada infectada con H. pylori se reportó un mayor perfil de metilación en estados avanzados de las lesiones gástricas, es decir pacientes con DG y CG, sin embargo no difiere significativamente cuando se compara con estados menos avanzados de la enfermedad. Resultados similares fueron encontrados en un estudio que reportaron inactivación del gen TGF-β1 por un estado de metilación de la región promotora, indicando la posibilidad de ser un importante mecanismo en el desarrollo de malignidades más severas (35).

Este estudio encontró que pacientes con DG y H. pylori positivos presentaron mayor estado de metilación del gen RUNX3 seguido de las personas con CG comparados con estados previos de la enfermedad. Con relación a otros resultados, varios estudios han demostrado la metilación aberrante del gen RUNX3 como el principal mecanismo de su expresión deficiente en tejidos con CG (36, 37). El estudio de Kitajima, et al., 2008 (38) demostró que la infección persistente con H. pylori durante un largo período induce a la metilación de Runx3 y posterior pérdida de la expresión del gen lo cual puede afectar a la carcinogénesis gástrica. Otro estudio demostró que la metilación en el gen RUNX3 es un factor de riesgo y biomarcador para la detección temprana de la carcinogénesis gástrica en pacientes con gastritis crónica e infectados con H. pylori (39).

El análisis de la metilación del gen IL-10 no mostro ninguna diferencia significativa entre los pacientes con diferentes lesiones preneoplasicas e infectadas con H. pylori. Son pocos los estudios que han estudiado el papel de la metilación del gen IL-10 en pacientes con CG o su relación con la infección de H. pylori, sin embargo se ha demostrado que un desbalance en la concentración de la proteína IL-10 está asociada a diferentes enfermedads. Solo un estudio ha reportado que la infección con H. pylori

puede altera la expresión de la proteína a través de la metilación o acetilación (40). Este estudio, indica que personas con GCNA y MI presentaron mayor porcentaje de metilación lo que posiblemente esté relacionado con un estado que favorece los

mecanismos inflamatorios en las células epiteliales de la mucosa gástrica de estos pacientes.

Este es el primer estudio en determinar un perfil de metilación de los genes IL-6 e IL8 en personas con distintas lesiones preneoplasicas y CG a pesar de que no encontramos diferencias significativas. Un estado de hipermetilación de esta citoquina relacionada con un procesos pro-inflamatorios podría implicar la reducción en la expresión de la proteína, sin embargo no podemos asumir que los niveles de la citoquina son diferentes en estados avanzados de la enfermedad gástrica y que están mediados por la infección con H. pylori. Se necesitan por lo tanto más estudios para dilucidar el papel de la bacteria, la metilación del gen IL-6 e IL-8 y los estados preneoplasicas del CG.

La metilación del gen CDKN2A (p16) ha sido ampliamente estudiado debido a su rol en el ciclo celular. El presente estudio encontró un porcentaje de metilación significativamente mayor en personas con CG en comparación con personas sin CG. Estos resultados están acorde a otros estudios, en los que encontraron inactivación funcional del gen p16 producto de la hipermetilación, proceso implicado en la patogénesis gástrica relacionada con la infección con H. pylori. Además puede ser un biomarcador útil para la predicción del potencial maligno de la displasia gástrica (41-43). El estado de metilación del gen VEGFA, no difirió entre las distintas lesiones preneoplasicas, por lo tanto no podemos inferir que sea un marcador de riesgo para el desarrollo de CG, pero el papel en la tumorogenesis es clara y su asociación con CG ha sido estudiada (44). No es claro el papel de la metilación en el gen VEGFA y la relación con la infección con H. pylori, pero se sabe que este tipo de infección induce a la hipermetilacion de varios genes para favorecer su supervivencia en las células del huésped, induciendo un estado patológico grave y posterior desarrollo de CG (32). La información del estudio es el primer reporte del perfil de metilación en pacientes con lesiones gástricas y CG en caucanos, generando bases que permitan delinear el rol de la epigenética en las bases moleculares del CG en la búsqueda de biomarcadores para uso clínico o poblacional. En este sentido uno de los genes que podría inferir un rol relevante epigenético es CDKN2a (p16), para ello se sugiere continuar estudios a futuro para dilucidar su papel como biomarcador en CG.

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