face meetings on the basis of online engagement
3.3 Part 3: Analysis of the data
3.3.1 Treating each case holistically – applied narrative analysis Narrative analysis has been applied increasingly in the social sciences, paying
En las muestras extraídas durante el monitoreo se midió además de la
biomasa, el porcentaje de azúcares residuales(Anexo 09) y el valor del pH
(Anexo 10), utilizando un brixómetro y un pH-metro, respectivamente.
Los valores de azúcares residuales y de pH obtenidos en los tres ensayos se
ordenaron en tablas, se promediaron y con estos se construyeron los gráficos
correspondientes (Anexo 09 y 10).
Además, una finalizado el proceso (Anexo 11) se determinó el porcentaje de
etanol (Anexo 12); para lo cual se añadió a cada biorreactor 200 mg de
bisulfito de sodio por litro de medio fermentado; luego se filtró cada mosto
los mismos que fueron destilados; se procedió de forma similar con el
testigo (Anexo 13). Finalmente se midió el porcentaje de etanol empleando
un alcoholímetro.
Los datos del porcentaje de etanol obtenidos en cada uno de los cuatro
biorreactores se procesaron y se graficaron para comparar la producción de
etanol en cada uno de ellos (Anexo 12).
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2.12 Análisis de datos
Los valores de la velocidad específica de crecimiento de S. cerevisiae MIT-
L51 en mostos de frutos de maracuyá, piña y uva; así como en el testigo
obtenidos en las tres repeticiones, fueron analizados estadísticamente
mediante la prueba de t de Student para comparación de promedios en cada
biorreactor82 (Anexo 14).
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22 RESULTADOS
Al evaluar la velocidad de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae MIT-L51
en mostos de frutos de Passiflora edulis “maracuyá”, Ananas comosus “piña” y Vitis
vinifera var. gross colman “uva” durante el proceso de fermentación alcohólica, se obtuvieron los siguientes resultados:
En la Fig. 01 se presentan las curvas de crecimiento de Saccharomyces
cerevisiae MIT-L51 en cuatro biorreactores; tres conteniendo los mostos de los frutos de maracuyá, piña y uva; y el último Caldo Sabouraud Sacarosado modificado
utilizado como testigo. La tendencia del crecimiento es similar en los cuatro
biorreactores; sin embargo, se observa un mayor crecimiento en los mostos de los
tres frutos a diferencia del testigo.
La Figura 02 muestra gráficamente la fase exponencial de crecimiento de
S.cerevisiae MIT-L51, expresada en una ecuación lineal de crecimiento durante 60 horas de fermentación. Se presentan diferentes curvas en los tres mostos y en el
testigo, observándose la mayor pendiente en el mosto de piña y la menor, en el
testigo.
En la Fig. 03, se presentan los valores de las velocidades específicas de
crecimiento (µ) de Saccharomyces cerevisiae MIT-L51, expresados en h-1. Se
observa una mayor velocidad de crecimiento en los tres mostos en comparación con
el testigo; asimismo, el valor de µ es similar en los mostos de maracuyá y uva, y
mayor en piña.
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Fig. 01. Curvas de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae MIT-L51 en mostos de
frutos de Passiflora edulis “maracuyá”, Ananas comosus “piña” y Vitis
vinifera var. gross colman “uva”, y en Caldo Sabouraud Sacarosado modificado (CSSm) utilizado como testigo, durante 180 horas de
fermentación alcohólica.
La fermentación se realizó a temperatura ambiental (23±1°C) en biorreactores cilíndricos de 850 mL. de capacidad. El crecimiento se cuantificó en Agar Sabouraud Glucosado enriquecido. 1.0E+06 1.0E+07 1.0E+08 1.0E+09 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168 180 (U F C /m L )
Tiempo de fermentación (horas)
CSSm Maracuyá Piña Uva
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24
Fig. 02. Fase exponencial de crecimiento de S. cerevisiae MIT-L51 en mostos de
frutos de Passiflora edulis “maracuyá”, Ananas comosus “piña” y Vitis
vinifera var. gross colman “uva”, y en Caldo Sabouraud Sacarosado modificado (CSSm) utilizado como testigo, durante 60 horas de
fermentación alcohólica.
La fermentación se realizó a temperatura ambiental (23±1°C) en biorreactores cilíndricos de 850 mL de capacidad. La curva de la fase exponencial fue construida mediante regresión lineal y expresada en una ecuación lineal de crecimiento.
y = 0.0444x + 16.213 y = 0.0761x + 15.551 y = 0.0952x + 16.407 y = 0.0825x + 16.404 15 16 17 18 19 20 21 0 12 24 36 48 60 ln de U F C /m L
Tiempo de fermentación (horas)
Testigo Maracuyá Piña Uva Testigo Maracuyá Piña Uva Experimental Maracuyá Piña Uva CSSm Regresión lineal Maracuyá Piña Uva CSSm
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Y COMUNICACIÓN
Fig. 03. Velocidad específica de crecimiento (µ) de Saccharomyces cerevisiae MIT-
L51 en mostos de frutos de Passiflora edulis “maracuyá”, Ananas comosus
“piña” y Vitis vinifera var. gross colman “uva”, y en Caldo Sabouraud
Sacarosado modificado (CSSm) utilizado como testigo, durante el proceso
de fermentación alcohólica.
La fermentación se realizó a temperatura ambiental (23±1°C.) en biorreactores cilíndricos de 850 mL de capacidad. El valor de µ se calculó mediante regresión lineal.
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.1
Maracuyá Piña Uva CSSm
0.0761 0.0952 0.0825 0.0444 µ (h ) Medio de fermentación -1 (P < 0.05)
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Y COMUNICACIÓN
26 DISCUSIÓN
El crecimiento de una levadura es el aumento ordenado de sus estructuras
celulares; es pues, un proceso que partiendo de los nutrientes del medio circundante
que constituyen la fuente de materia y energía, termina en un aumento del tamaño y
peso de la célula. Este proceso está ligado a su genoma a través de un sistema de
transmisión de información12,13,83. Para que este crecimiento se genere el medio de cultivo debe tener todos los nutrientes necesarios81,84; sobre todo si se realiza en condiciones de anaerobiosis, en el cual las células no son capaces de crecer a la
misma velocidad que en aerobiosis realizando principalmente procesos de
fermentación6. En esta investigación se utilizaron mostos de frutos de maracuyá, piña
y uva, los cuales según Ribéreau-Gayon y col.27, Moreiras y col.28, Reyes y col.29, reportan que tienen cantidades suficientes de fuentes de carbono, nitrógeno y
minerales que garantizan el crecimiento de las levaduras. Los datos obtenidos que se
presentan en las Fig. 01 y 02 evidencian que Saccharomyces cerevisiae MIT-L51
crece, en anaerobiosis, en los mostos de maracuyá, piña y uva; así mismo, en Caldo
Sabouraud sacarosado modificado, utilizado como testigo.
Al analizar además las Fig. 01 y 02 se observa un mayor crecimiento de
S.cerevisiae MIT-L51 en los mostos de maracuyá, piña y uva en comparación al testigo. Estos resultados se pueden sustentar en la composición fitoquímica propia de
cada fruto, la cual brinda nutrientes y factores para su crecimiento y capacidad
fermentativa (Anexo 12); a diferencia del testigo cuya composición diferente (Anexo
06) conlleva a que su producción de biomasa y etanol se vea disminuida. Esta
observación, se sustenta en que las levaduras crecen en un medio de cultivo sólo si
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este contiene todos los nutrientes necesarios en forma disponible, tanto para la
síntesis del material celular como para la producción de metabolitos; también es
necesario que los factores ambientales sean los adecuados85,86. Según Pellon87 un medio de cultivo balanceado debe incluir una combinación de fuentes de carbono y
nitrógeno, macroelementos, microelementos y factores de crecimiento.
En la Fig. 01 no se observa fase de latencia de S. cerevisiae MIT-L51 en los mostos de piña y uva al inicio del crecimiento. Este hecho se produce porque estos
mostos contienen tiamina en cantidades mayores en relación al mosto de maracuyá,
que es considerado pobre en tiamina28,88, aún cuando la levadura es capaz de
sintetizarla de novo, ve su crecimiento acelerado y ampliado en presencia de esta vitamina24, por lo que es considerada como un potente activador del crecimiento, estimulando el metabolismo y siendo consumida en gran cantidad en la fase de
multiplicación celular, incluso más de los niveles del mosto de partida18,27.
Asimismo, en base a esta composición se puede explicar porqué, en los mostos de
piña y uva S. cerevisiae MIT-L51 describe la misma tendencia de crecimiento
acelerado hasta las 12 horas de fermentación.
De igual modo, el mayor aporte de ácido pantoténico presente en los mostos de
piña y uva28, acorta la fase de latencia, favoreciendo los fenómenos de síntesis de
proteínas89, asegurando de esta manera un rápido crecimiento; Hidalgo18, Melo y
Cuamatzi90 afirman que esta vitamina en condiciones de fermentación representa uno
de los factores de crecimiento más potentes e imprescindibles para la actividad
metabólica de las levaduras. Sin embargo, Hidalgo18 señala además que, su
importancia radica en que es un constituyente de la coenzima A, cofactor que
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28
interviene en las reacciones de acetilaciones biológicas. Mientras que para dicho
autor, es necesario que el mosto contenga un nivel suficiente de este compuesto
debido a que algunas cepas de Saccharomyces son incapaces de sintetizarla; para
Monk91, las levaduras de este género tienen la capacidad propia de sintetizar esta vitamina. Por lo tanto, se puede afirmar que la capacidad de sintetizar o no el ácido
pantoténico varía con la cepa de la levadura.
Por lo anteriormente expuesto se afirma que, el mayor contenido de tiamina y
de ácido pantoténico en los mostos de piña y uva, permite que S. cerevisiae MIT-L51
no requiera una etapa de adaptación, que es lo que sucede en la fase de latencia. Sin
embargo, en el mosto de maracuyá se observa un periodo de latencia hasta las 12
horas (Fig. 01), lo que indica que las levaduras necesitan un tiempo relativamente
largo para adaptarse a las nuevas condiciones del medio de fermentación y que el
mayor o menor tiempo de duración de esta fase va a depender de la composición del
mosto en el cual desarrolla; también es necesario considerar la fuente carbonada
energética y la fuente nitrogenada50.El mosto de maracuyá contiene menor cantidad
de tiamina y ácido pantoténico28; por lo que se puede considerar que este mosto
requiere ser suplementado con estas vitaminas. Mercedes89 afirma que este aporte
vitamínico tiene un efecto estimulante deseable sobre el crecimiento temprano de las
levaduras, lo que coincide con los datos obtenidos en esta investigación.
Según Jiao92 en investigaciones recientes sobre el análisis de la actividad de la
levadura y la utilización de sustratos de jugos de frutas tropicales como la piña,
papaya y mango se encontró un alto grado de adaptabilidad de las levaduras en estos
sustratos manifestándose la ausencia de una fase de latencia en su ciclo de
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crecimiento; la piña fue la fruta con la que se obtuvo mejores resultados en la
elaboración de vinos de fruta tropical, mientras que para el mango y la papaya se
recomienda aumentar la cantidad de azúcar.
Con respecto a la fase exponencial del crecimiento de S. cerevisiae MIT-L51
en condiciones de fermentación, se observa en las Fig. 01 y 02 que su crecimiento es
similar al inicio de esta fase en los mostos de los tres frutos utilizados; esto se explica
por su contenido de amonio, que además de la cantidad que poseen en forma natural
han sido suplementados con la misma concentración de sulfato de amonio. Según
Mercedes89, Raynal y col.93 cuando las levaduras crecen en presencia de amonio y aminoácidos utilizan preferentemente el amonio, el cual es asimilado rápidamente
evidenciándose en un crecimiento significativo. Este análisis es coherente con los
datos del Anexo 09, donde se observa una caída brusca de los azúcares residuales en
los mostos de maracuyá, piña y uva a inicios de la fase exponencial, los cuales son
utilizados en el crecimiento y en la producción de metabolitos14,18,27,38,94, por lo que
el consumo de azúcares aumenta. También es válido aclarar que, a pesar que el
testigo presenta la misma tendencia de crecimiento en este periodo, esta es menor en
comparación con los mostos de maracuyá, piña y uva, puesto que sólo posee sulfato
de amonio suplementado como fuente nitrogenada.
Así mismo, Ribéreau-Gayon y col.27 consideran que la incidencia de un aporte
de nitrógeno con respecto a la cinética de la fermentación se ve afectada por el
contenido de azúcares del mosto. En la presente investigación los mostos fueron
suplementados con azúcar blanca doméstica hasta 25°Brix. No se adicionaron
mayores cantidades debido a que Ribéreau-Gayon y col27 afirman que elevadas
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30
cantidades de sustrato superiores a 200 g/L interfieren con la finalización de la
fermentación, causando su interrupción espontánea para cantidades de azúcar
residual muy próximas. Independientemente de la suplementación con nitrógeno;
Nishino y col.95 sostienen que durante la fermentación, cuando la concentración de azúcar inicial es elevada, la fase lag se prolonga, asimismo la viabilidad celular y los
recuentos de células viables disminuyen; en base a esta afirmación se puede concluir
que la fermentación se retarda quedando elevados niveles de azúcar residual. Por lo
tanto, no se recomienda fermentar mostos con concentraciones mayores a 45 % (p/p),
porque bajo condiciones osmófilas las levaduras se afectarían al eliminar
bruscamente el agua de sus vacuolas para equilibrar las concentraciones de soluto en
el exterior, y en el interior de la célula ocurriría una plasmólisis96 reducción del poro
y otras alteraciones que disminuyen su crecimiento23, lo cual sugeriría la baja o nula
producción de etanol23. En suma, una tasa de azúcar elevada afectaría el crecimiento
de la levadura y disminuiría la población máxima, reduciéndose la fermentación
incluso antes de la aparición de una cantidad significativa de etanol que agrega su
efecto antiséptico27.
Un aspecto que debe ser analizado es que la suplementación con amonio a
pesar de ser considerada como una buena alternativa para activar tempranamente el
metabolismo de las levaduras27 a la concentración ensayada73, no es capaz de
acelerar el crecimiento de la población en sus inicios en el mosto de maracuyá; esto
quizás se deba a la acción conjunta con los índices inferiores de las vitaminas
anteriormente indicadas (tiamina y ácido pantoténico) que conducen al desarrollo de
una fase de latencia. Esto permite proponer concentraciones mayores de sulfato de
amonio en el enriquecimiento del mosto de maracuyá para acortar la fase de
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adaptación, y suplementar con vitaminas principalmente la tiamina y ácido
pantoténico.
El crecimiento acelerado de S. cerevisiae MIT-L51 hasta las doce horas de
fermentación en los mostos de piña y uva describe la misma tendencia (Fig. 01), esto
es debido que además del nitrógeno, carbono y minerales disponibles28, tienen
mayores concentraciones de tiamina, que el mosto de maracuyá28,88. Como se analizó
anteriormente esta vitamina es importante en el crecimiento de las levaduras. De
igual manera el ácido pantoténico visto en párrafos anteriores contribuye a un mayor
enriquecimiento de los mostos, particularmente en los de piña y uva, donde su
contenido vitamínico es superior frente al mosto de maracuyá28, influyendo
positivamente en el crecimiento celular.
Pasado las doce horas de fermentación, en el mosto de piña se produce mayor
cantidad de biomasa que en el mosto de uva hasta las 36 horas que dura la fase
exponencial (Fig. 01); esta diferencia en el comportamiento del crecimiento se debe a
que la concentración de tiamina es mayor en relación a la uva, pues al tener una
mayor población de levaduras estas sintetizarán mayores cantidades de esta
vitamina24; y a su contenido nutricional28, cuya composición porcentual es
generalmente mayor con respecto a la uva favoreciendo de este modo el crecimiento,
que conlleva a alcanzar la biomasa máxima; a diferencia del mosto de uva cuyo “menor” aporte nutricional genera el término de una fase exponencial con una producción de biomasa reducida, ya que los nutrientes esenciales son los primeros en
agotarse, condicionando así un crecimiento disminuido.
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32
Al considerar los resultados de este ensayo sobre la máxima población de
levaduras alcanzada al término de la fase exponencial, se observa que en las Fig. 01 y
02 el mayor crecimiento de S. cerevisiae MIT-L51 se da en el mosto de maracuyá.
Sin embargo al ser analizado estadísticamente en simultáneo con la biomasa obtenida
en el mosto de piña, mediante la prueba de t de Student para comparación de
promedios, se observó que no existe diferencia significativa entre ambos mostos
(Anexo 16). Por lo tanto, aunque aparentemente muestren valores distintos estos son
iguales. Esto podría explicarse porque a pesar que el mosto de maracuyá contiene la
mayor concentración de nitrógeno asimilable, posee ciertos nutrientes en menor
proporción y sobre todo por el contenido pobre en factores de crecimiento en
relación a la piña28; compensado así un balance nutricional equivalente al aportado por el mosto de piña. No obstante cabría considerar, que debido al desarrollo de una
fase de latencia producida por S. cerevisiae MIT-L51 en el mosto de maracuyá (Fig.
01), las células de levaduras se encuentran metabólicamente activas consumiendo
parte de los nutrientes del medio fermentativo, con la finalidad de sintetizar nuevas
enzimas que le permitan adaptarse a las nuevas condiciones del medio que van
cambiando durante el proceso14,17; por lo cual disminuyen la concentración de
nutrientes del mosto especialmente la fuente carbonada (Anexo 09) y nitrogenada50,
comenzando así con una tasa menor su fase exponencial; en consecuencia su
crecimiento se reduciría llegando al término de esta fase con una biomasa igual a la
obtenida en el mosto de piña ya que estos nutrientes no son utilizados por las
levaduras para crecer exclusivamente en forma logarítmica como sucede en el caso
del mosto de piña.
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Los resultados obtenidos al analizar el crecimiento de S. cerevisiae MIT-L51 en los mostos de maracuyá, piña y uva, permiten afirmar que, las levaduras tienen
necesidades vitamínicas en los procesos fermentativos, debido a que éstas forman
parte de las coenzimas que intervienen en el metabolismo productor de energía, por
lo que el aporte de tiamina y ácido pantoténico contenidos en los mostos tiene un
efecto estimulante sobre el crecimiento y la fermentación89. Así mismo, se señala que
el estudio de los requerimientos nutricionales en las levaduras tiene una influencia
directa sobre su crecimiento, esto en proporción a los nutrientes presentes en los
mostos que van a condicionar e influir en el desarrollo de la fermentación alcohólica;
destacando las sustancias carbonadas, nitrogenadas, y las minerales18,97.
S. cerevisiae encuentra azúcares fermentables en los mostos de maracuyá y piña28,29 y uva18,27, los cuales constituyen la principal fuente de carbono, especialmente glucosa, fructosa y sacarosa contenidos en diferentes concentraciones
según la naturaleza química del mosto. Estos azúcares no sólo están presentes en
forma natural, también pueden ser adicionados intencionalmente mediante
chaptalización18,98. Como se indicó anteriormente, en este ensayo se corrigió el
azúcar de los tres mostos, adicionando sacarosa hasta alcanzar 25 °Brix, debido a
esto la concentración de azúcar no representa una variable en la composición
porcentual de azúcares totales en los mostos utilizados. Ribéreau-Gayon y col27,
Hidalgo18, De Rosa38, Fajardo y Sarmiento9 reportan que las levaduras utilizan estos
azúcares para sintetizar sus componentes estructurales, así como también de fuente
de energía para atender sus funciones vitales; permitiendo el desarrollo y la
constitución de nuevas células de levaduras.
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34
A diferencia de la fuente carbonada, el nitrógeno disponible para el desarrollo
de las levaduras varía según la composición del mosto utilizado, siendo mayor en el
maracuyá, seguido por la uva y finalmente pero muy cercano a este último por la
piña28. La presencia de nitrógeno como nutriente celular durante la fermentación
favorece que la misma se lleve a cabo en forma completa. Si este nutriente no está
presente, el proceso se paraliza aún cuando la concentración inicial de azúcar sea
alta99. Beltran y col.100indican que durante el inicio de la fermentación, las células de levadura mantienen una tasa de división muy rápida y captan la mayoría de fuentes
nitrogenadas disponibles, siendo asimilados y degradados en orden de preferencia, utilizando diferentes mecanismos moleculares (“Represión por catabolito del