A B S
T
R A C T
D
A R R Y
L
C A R ST
E N SE N
:C
ult
i
v at
i
o n-in
d
e
p
e nd
e nt
I
d
e nt
i f
i c ati
o n of
P
h
e n ol
-d
eg
r ad i
ng
B
a ct
e ri
ai
nA
ct
i
v at
ed Slu
d
g
eb
y
St
ab le
I
s ot
op
eP
r ob i
ng
(
U
nd
e
rt
h
e
d i
r e ct
i
o n of
M
i
ch
a el A i
t
k
e n)
T h
e a ct
i
v at
ed
sl
ud
g
ep
r o c e s sis
th
em
o st
c om m
o nl
y
u s ed
p
r o c e s sf
o rm
u nic
i
p
al
w
a st
ew
at
e rt
r e at
m
e nt
i
nt
h
eU
ni
t
ed
St
ate s
.M
ol
e c ul
a rm
et
h
od
sin
m ic r o
b io
lo
g y
h
a v ep
ro
vi d
ed m
o
r ed
e
t
ai l
ed i
ns
i g h
t
of
th
e a ct
iv a
t e
d
sl
ud g
ep
r o c e s si
n r e c e nt
y
e a r s.H
ow
e v e r ,m
o
st
of
th
e
s em
et
h
od
ss
t
i l l
r el y
up
o n c ul
tu r
in
g
of i
s ol
at
e sf
o r ch
a r a ct
e riz
a
ti
o n of
t
h
ep
h
y
si
olo
g y
of
a n o rg
a ni
sm
a nd
e xtr a
p
ol
at
i
o n of
t
h
o s e ch
a r a ct
e ri
st
i
c st o
m
o r e c om
p
le x
s
y
st
em
sf
o rth
e st
ud
y
of
e n vi
r o nm
e nt
al
s am
p
l
e s.St
ab l
ei
s ot
op
ep
r ob i
ng
(
S
I P
)
i
s am
et
h
od
w
h i
ch
cir c u
m
v e nt
st
h
e r eq
ui
r em
e nt
of
c ul
t
u ri
ng i
s ol
at
e sto
i d
e nt
i f
y
f
u n ct
i
o n al l
y
r el
e v a nt
o r
g
a ni
sm
si
n a sy
st
em
.SI P i
n v olv e s
i
n c ub
at
i
ng
am i
c r ob i
al
c om m
u nit
y
w
i
th
a ^ ^C
-la
b
ele
d
c a r
b
o n so
u r c e,t
h
e
n r e c o v e ri
ng
' ^C
-e n r
i
ch
ed
n u cl
ei
c ac
i d
s
b
y
d
e n sit
y
-g
ra
d ie
nt
u
l
t
r a c e nt
ri fU g
at
io n
.I
nt
h i
s stu
d
y
,S
I P w
a s ap p
l i
ed
t
o ap
h
e n ol
-d
eg
r ad i
ng
a cti
v at
ed
sl
ud g
e c om m
u ni
t y
a
nd
f
ol l
ow
ed b
y
d
e n atu r a n
t g
r ad i
e nt
g
el
el
e ct
r op h
o r e si
s(
D
G G
E
)
fi
ng
e rp
rin
t
i
ng
a nd
c o n st
r u ct
i
o no
f 16 S
rR
N A g
e
n e cl
o n el i b
r a ri
e sf
o ri d
e nt
i fi
c ati
o n of
p
h
e n ol d
eg
r ad
e r sb y p
h y
l
og
e n et
i
ca n
a
l
y
sis
.T h
e ef f
ec
t
so
nS I P
re
s ult
s of p
uls e
(
sp i k
e)
ad d i
t
io n
of p h
e no
l
w
e
r e c om p
a r ed
t
ot
h
o s e of
sl
ow
, c o nt
i
n u o u s ad d i
ti
o no
f p h
e n ol
.A l
s o ,th
e ef f
e ct
s of
ch
em
o st
at
e
n ric
h m
e nt
of
t
h
e a ct
i
v at
ed
sl
ud
g
e c om m
u ni
t
y
w
i
t
h
p
h
e n ol
a s a s ol
e c a rb
o n s o u r c ew
e re
e x am i
n ed
.S
eq
ue
n c e s of m
aj
o rp h
e n ol
-d
e
g
r ad i
ng b
a ct
e ria
cl
o s el y
r ela
t
ed
t
ot w
oP
-p
r ote
ob
ac
t
er
ia
l
s e
q
u e n c e sp
r e vio u s
l y
i m
p
l i
c at
ed i
np
h
e n ol
-d
e
g
r ad in
g
a ct
i
v at
ed
slu
d
g
ew
e r e r e c o v e r ed
.H
ow
e v e r,t
h
em
o st
ab
u nd
a nt
s eq
u e n c e a s s o ci
ate
d
w
it
h
p
h
e n ol d
eg
r ad
ati
o nw
a s r el
ate
d
t
oo r
g
a nis
m
si
nt
h
ea
-p
r ot
e ob
a cte r
i
aw h i
ch h
a v e n ot
b
e e np
r e vi
o u sl y
i m
p l
i
c at
ed i
np h
e n ol
d
eg
r ad
at
io n
in
w
a st
et
r e at
m
e nt
sy
st
em
s.T
h
em
et
h
od
of
[
U
-' ^C
]p
h
e n ol
ad d i
ti
o nin
SI P
in c u
b
at
io n s
af f
e cte
d
th
ed
eg
r e e of
C
-la
b
e
l in
g i
nt
h
eSI P
e
xp
e ri m
e nt
,w i
t
h
t
h
e sp i k
e
-f
e
d
s am p l
e sb
ei
ng
m
o r eh
e a vi l
y
la
b
ele
d
t
h
a nt
h
e co
nt
i
n uo
u sl y f
ed
s am p l
es
.T h i
sfi
nd i
ng
c a
nh
a v ei m p l i
c at
i
o n sf
o
rt
h
ed
e si g
na
nd
in
t
e rp
r et
at
io n
of fu
t
u r eSI P
e xp
e ri m
e nt
s.T A
B
L
E
O F C O N T
E
N T S
L I
S
T
O
F T
A B
L E
S
vi
L
I
S T O
F F I
G U
R
E S
vi i
C
H
A P
T E R
1
.I
N
T R
O
D
U C
T I
O
N A
N
D B
A C K G
R
O U N D
1
C
H
A P
T E
R 2
.M
A T E R
I
A L S A N
D
M
E T H O
D
S
9
O
ve
r vie
w
of
E
xp
e ri m
e nt
9
C h
em i
c al
s
10
C h
em
o st
at
E
n ric
h
m
e nt
1 1
M
o
ni
t
o ri
ng
of C h
em
os
t
at
a nd
I
nc
ub
at
io
n s12
P
h
e n ol D
eg
r ad
at
i
o nK i
n et
ic s
12
P
re
-e n r
i
ch m
e nt
S
I P I
n c ub
at
io n
1
5
P
os
t
-e
n ric
h m
e nt
SI P I
nc
ub
a
t
io n
1 5
D
N
A E
xt
r a ct
io n
16
Se
p
a r at
io n
a nd
I
s ol
ati
o n of D N
A
17
M
o
l
e c ul
a rA
n al y
s e s1 7
C
H
A P T
E
R 3
.R E SU L T S
19
C h
em
o st
at
O p
e r at
i
o n19
R
e sp i
r om
et
ry
a nd
P
h
e n ol D
eg
r ad
at
i
o
nK i
ne
t
i
c
s2 0
S
I
P
a nd D G G E
of 16
s rR N A G
e n e s2 2
P h y l
og
e n et
ic
A
n al
y
si
s of 16
s rR N
A
G
e n eC lo
n eL
i b
r a rie s
2
7
C
H A P T E R 4
.D I
S C U SS I O N
3 3
W
O R K S C
I T
E
D
3
6
L I ST O
F T
A
B L E
S
T
ab l
e1
.C h
em
o st
at
M
e a s u r em
e nt
s ^2
0
T
ab
l
e2
.R
e s ult
s of N
o nl
i
n e a rR
eg
r e s si
o n of
R
e sp
i
r om
et
ry D
at
a2 1
T
ab l
e3
.C l
a s si f
i c at
i
o n of
1
6 8
rR
N
A
G
e n eC l
o n e s3 0
T
ab l
eA
-1.
C h
em
o st
at E
f f l
u e nt
M
e a s u r em
e
nt
sA
-1
T
ab l
eA
-2
.
R
e sp
i
r om
et
ry
R
e s ul
t
sA
-
2
T
ab l
eA
-3
.P
o st
-
i
n c ub
at
i
o nP
h
e no
l C
o n c e nt
r at
i
o n of S I P
I
n c ub
at
i
o n sA
-2
T
ab l
eA
-4
.
O
p
e r at
i
o n al T
a x o n om i
cU
ni
t
(
O T U
)
G
r o up i
ng
sA
-
5
T
ab l
eA
-5
.
A
c c e s si
o nN
um b
e r s of S
eq
u e n c e sO b
t
ai
n ed f
r om C l
o n eL
i b
r a ri
e sA
-6
L
I ST O
F F I
G U R
E
S
F i g
u r e1
.E
xp
e ri m
e nt
al O
v e r vi
ew
1
0
F
i g
u r e2
.S
ch
em
afi
c of C h
em
o st
at
O
p
e r at
i
o n1
2
F
i
g
u r e3
.O
v e r vi
ew
of
S
I P I
n c ub
at i
o n s1 6
F
i g
u re
4
.M
i
x ed
L
i q
u o rR
e sp i
r om
et
ry
R
e s ul
t
s2 1
F i g
u r e5
.P
os
t
-
e
n ri
ch m
e nt
SI P K i
n et
i
cM
od
el R
e s ul
t
s2 3
F i g
u r e6
.S
I P
S
ep
a r at
i
o nR
e s ul
t
s2 4
F i g
u r e7
.D G G
E
of S
I
P F
r a ct
i
o n s a nd C h
em
o st
at
M
i
x ed
L
i q
u o r2
6
F
i g
u r e8
.16 S
rR
N A G
e n e-
b
a s ed
P
h
y
l
og
e n efi
cT
r e e2 8
F i g
u re
A
-1
.
D G G E
of SI P F
ra c
t
i
o
n sf
ro
m I
nc
ub
a
t
i
o n8 2
A
-
3
F
i g
u r eA
-2
.
D
G G
E
of S
I P F
r a ct
i
o n sfr
om
I
n c ub
at
i
o nC
2
A
-
4
C H A
P
T
E
R
1
I N
T R O D U C
T
I O N
A N
D B A C K G R O U N D
D
e sp
it
et
h
e c e nt
r al it
y
of
th
e a ct
i
v at
ed
sl
ud
g
ep
r o c e s st
ow
a st
ew
at
e rt
r e at
m
e nt
,r e
l
at
i
v el
y
l i
t t
l
ei
sd
ef
i ni
t
i
v el
y
k
n ow
n ab
o ut
t
h
em i
c r ob i
al
e c ol
og y
th
at
g
o v e r n si
t
.T
r ad i
t
i
o
n al l y
,w
a st
ew
at
e rt
r e at
m
e nt
sy
st
em
sh
a ve
b
e e nd
es
i g
n ed
u si
ng
ag g
r eg
at
ep
a r am
et
e r st
o ch
a r a ct
e ri
z et
h
ew
a st
e st
r e am
s-
b i
o ch
em i
c al
o xy g
e nd
em
a nd
(
B
O
D
)
,t
ot
al
s u sp
e nd
ed
s o
l i d
s(
T
S S
)
, o rt
ot
al K
j
el d
ah l
ni
t
r og
e n(
T
K N
)
f
o r e x am
p
l
e.T
h
em i
c r ob i
al
e c ol
og y
of
th
e s es
y
st
em
sh
a sf
o c u s ed
o n op
e r at
i
o n al
ch
a ng
e s, s u ch
a sth
e e st
ab l i
sh m
e nt
of
a e r ob i
c a nd
a n a e r o
b i
c z o n e s,t
o s el
e ct
c om m
u nit
i
e s of
o rg
a ni
sm
sw
h i
ch
p
e rf
o rm
s u ch b
r o ad l
y
d
efi
n ed
b i
o ch
em i
c al
op
e r at
i
o n s a s r em
o v al
of B O
D
,T K N
, o rp h
o sp
h
o r u s.T
h
e s e ag
g
r eg
at
ep
a ra
m
et
e r s a nd
b i
o ch
em i
c al
op
e r at
i
o n sp
r o vi d
ep
r a cti
c al l
y
u s ef
ul
i
nf
o rm
at
i
o nt
oth
ew
a st
ew
at
e r e ng
i
n e e r a nd
p
r o vi d
e ab
a si
sf
o rm
od
el i
ng
of
w
a st
ew
at
e rt
r e at
m
e nt
sy
st
em
s,b
ut
m
o r efi
n el
y
d
et
ai l
ed i
nf
o rm
at
i
o n ab
o ut
t
h
e c o n sti
t
u e nt
s
of w
a st
ew
at
e rs t
r e am
sa
nd
t
h
em i
c r ob i
al i
nt
e r a ct
i
o n sw
i
t
h i
nb i
ol
og i
c al
t
r e at
m
e nt
p
r o c e s s e si
s n e ed
ed i
n o rd
e rf
o rw
as
t
ew
at
e re n
g i
n e e r st
ob
et t
e rd
e si g
n a nd
op
e r at
et
h
o s ep
r oc
es
s e s.A d
v a n c es
i
nm
ol
ec
ul
a rb i
ol
og y
a r ep
r o vi d i
ng
a ne
x ci
t
i
ng
n ew
s et
of
t
o ol
s
w
it
h
w
h i
ch
w
a s
t
ew
at
e re n
g i
n e e rs
c a nm
o re
fi
n el y
c
h
a r a ct
e ri
z eb i
ol
og
i
c al
t
r e at
m
e nt
p
r o c e s s e s.W
e
m
ay
ob
t
a
in
i
nf
o rm
a
t
io
n ab
o
ut t
h
e co
m p
o s
i
ti
o
n of
a
m i
c
r ob i
al
co
m m
u nit
y
i
n si
t
ub
y
i
nt
e r r og
at
i
ng
t
h
e n u cl
ei
c a ci d
s of
th
eo
rg
a ni
sm
s
c om p
o si
ng
th
e co
m m
u nit
y
.N
u cl
eic
a ci d
p
r o vi
d
i
ng
al
e v el
of
d
et
ai
l p
r e vi
o u sl y
u n a v ai l
ab
l
ef
orb i
ol
og i
c al t
re at
m
e nt
p
ro c e s s e sA b
a si
cu n
d
e r sta n
d i
ng
o
f
t
h
e ch
em ic
a
l
st
r u ct
u r e of
n u cle
i
c a ci d
s a nd
t
h
e c e nt
r al d
og
m
a of m
ol
e c ula r
b i
o
l
og y i
s
f
u nd
a
m
e n
t
al
t
o
t
h
e
u nd
e r s
t
a
nd i
ng
o
f
t
h
e s e
m
e
t
h
od
s
.T h
ec e
nt
r al d
o
g m
a s
t
at
e
st
h
at
g
e n et
i
cin
f
o rm
at
i
o n st
o r ed i
nd
e o xy
ri b
o n u cl
ei
c a ci d
(
D
N A
)
i
str a n s c r
i
b
ed
t
o ri b
o n u cl
ei
c a ci d
(
R N A
)
,w h i
ch is
t
h
e ntr a n s
la
t
ed in
t
op
r ot
ei
n.A
d
e ep
e rlo o
k in
to
e a ch
st
ep
of
t
h i
sp
r o c e s sw
i l l
r e v e al
t
h
eq
u e st
i
o ns
w
h i
ch
w
e
c a na
n sw
e rf
r om kn o
w
l
ed g
eo
f
t
h
e ch
a r a ct
e ri
st
i
c s of
a no r
g
a ni
sm
's n u cl
e
ic
a
ci d
s
.T
h
e
"b l
u ep
ri
nt
s "o
f
a n o rg
a ni
sm
a r e c o nt
ain e
d i
ni
ts
D
N A
.I f
t
h
eg
e n e s e n c od in
g
ap
r ot
ein
n e c e s s a ry
f
o
r ap
a rt
i
c ula r
b i
o ch
em i
c al
p
r o c e s s a r e n ot
a v ai l
ab le
t
o a n o rg
a ni
sm i
ni
t
sD
N A
,t
h
e o rg
a
ni
sm
c a
n no
t
c a r ry
o ut
t
h
at
p
r o c e s s.T h
e r ef
o r e, a n o rg
a ni
sm
's
g
e ne
t
ic
c o
m
p
o si
t
i
o nd
ete r
m in e s
i
t
sp
h
e n ot y p
i
cp
o
t
e nt
ia
l
,a
nd kn o
w
l
ed g
e of i
t
sD N A
c a n a n sw
e rth
eq
u e st
i
o
n "w
h
at
b i
o ch
em i
c al
p
r o c ess e s
c a nt
h i
s o rg
a nis
m
p
e rf
o rm ?
"I
nw
a st
ew
a
t
e re n
g i
ne
e rin
g
,p
a rt
i
c ula
rl
y
f
o
rin
d
u st
ri
a
l
w
a st
ew
a
t
e
r ,t
h
eb i
o ch
em i
c al p
ro c e
ss
es
w
e a r ec o n c e r n e
d
w i
t
h
t
y p i
c al
l
y
i
n v ol
v eth
em
et
ab
ol i
ct
r a n sf
o rm
at
io n
of
ap
a rt
i
c ul
a r c om p
o u nd
.T
h
e r e a r e s e v e r al
t y
p
e s of R N A
,t
w
o of w h i
ch
a r em
o st
c om m
o nl
y t
a rg
et
ed b
y t
h
e s em
ole c u
la r
m
eth
od
s.T h
et
y
p
e of R N
A
re
f
e r r ed
t
oi
nt
h
e c e nt
r al d
o
g m
a
is
m
e s s e ng
e
rR
N
A
(
m
R
N A
)
.m R N A
c a r ri
e st
h
ein s
t
r u ct
io n s
fr
om
D
N
A
to
ri b
os o
m
e s,t
h
ep
r ote
i
nf
a ct
o ri
e s of
c e
l l
s,w
h
en
ag
en e
i
s e xp
r e s s ed b
y
t
h
e o rg
a ni
sm
.W
i
t
h k
no
w l
ed g
e of
a n o rg
a nis
m
'
s
m
R
N
A
w
e c a np
a rt
ia
l l
y
a n sw
e rt
h
eq
u e st
i
o n "w
h
at
b i
o ch
em i
c al
p
r o c e s sis
t h
e
o rg
a ni
sm
p
e rf
o
rm i
ng ?
"T h i
sq
u e st
i
o nm i gh
t
o nl y b
ep
a rt
i
al l y
a n sw
e re
d b
e c a u s e ap
r ot
ein
m
ay h
a
v em
o r eth
a n o n ef
u n ct
io n
a nd m
o r et
h
a n o n ep
r ot
ei
n c o ul d b
e r e sp
o n si b l
ef
o r ap
a rt
i
c ul
a rf
u n ct
i
o n .T h
e re
i
s st
i l l
al
e v el
of
u n c e rt
ain
t
y
ab
o ut
a n o rg
a ni
sm
's a c
t
i
vi
t y i
nt
h
ee
n vi
r o nm
e nt
T
h
e ot
h
e rt
y p
e o
f R N
A
of i
nte r e s
t
i
s ri b
o s om
al
R
N
A
(
rR N A
)
,w
h i
ch i
s o n e of
t
h
en e c e s s a r
y
c om p
o n e nt
s
of
af
u n cti
o ni
ng
ri b
o s om
e.F
o r s e v e r al
r e a so
ns
, rR N A
a nd
th
eg
e n e se n c o
d i
ng
f
o r rR
N A h
a v eb
e e nw
i d
el
y
ad
op
t
ed
a s ap
h
y
l
og
e n et
ic
m
a rk
e r(
p
h
y
lo
g
e ny
r ef
e r st
oe v o
l
ut
i
o n a ry
r ela
t
i
o n sh i
p
at t
h
em
ole c u
la r
l
e v el
)
.A
l l k
n ow
n o rg
a nis
m
sp
o s s e s s ri
b
o s om
e sa n
d
, c o n s eq
u e nt
l
y
, rR N A
.B
e c a u s e rR
N
A
i
s ub i q
ui
t
o u sth
e r ei
sl i
t t
l
ep
r e s s u r ef
o r a no r
g
a ni
sm
to
ob
t
ai
nt
h
e rR
N A g
e n e of
a n ot
h
e r o rg
a ni
sm b
y
h
o ri
z o nta
l g
e n et
r a n sf
e r, s ot
h
at
ag i
v e n rR N
A
m
ole c u
le
is
l i k
el
y t
ob
e u ni q
u et
ot
h
e o rg
a ni
sm
p
o s s e s sin
g i
t
.T h
e r e a r e r eg
io n s
o
f
t
h
e rR
N A m
ol
e c ul
e a nd
t
h
e rR
N A g
e n ew h i
ch
a r eh i
g
h l
y
c o n s e r v ed f
r om
o n e sp
e ci
e st
oa n o
t
h
e r,
b
ut t
h
e r e a r e al
s o r eg
i
o n sw h i
ch
v a ry
g
r e at
l
y
.T h
e rR N
A
g
e n e a nd
rR N
A
r em
ain
c o n s
t
a nt
e n o ug
h
(
i
nt
h
eh i
g h l y
c o n s e r v ed
a r e a s)
t
ob
e r e c og
ni
z ab l
ef
r om
o n e o rg
a ni
sm
to
a n o
t
h
e r,b
ut
al
s o
d i f f
e r s e n o ug
h
t
h
at
sm
al l
e v ol
ut
io n a r
y
ch
a ng
e s
fr
om
o n e o rg
a ni
sm
t
oa n o
t
h
e r c a nb
ed
et
e
ct
e
d
.F i
n al l
y
, rR
N A
a nd
t
h
e rR N A g
e n e c o nt
ai
ne
no u
g h i
nf
o rm
at
i
o nto
m
ak
e st
ati
st
i
c al l
y
si g
ni fi
c a nt
c om
p
a ri
s o n sb
et
w
e e nm
a ny
rR
N
A
m
ol
e c ul
e sw
h i le
p
r o vi d i
ng
afi
n el
e v el
of p h y l
o
g
e n e
t
ic
d
et
ai l
.T w
ot
y p
es
o
f
te c
h
ni
q
u e sm
ay
b
e u s ed
t
o st
ud
y
n u cl
eic
a ci d
s-
h
y
b
ri d i
z at
io n
t
e ch
ni
q
u e s a nd
am p l i fi
c ati
o nt
e ch
ni q
u e s.B
ot
h
t
e ch
ni
q
u e s r el y
o nt
h
e ab i l i
t y
of
c
o
m p l
e
m
e nt
a ry
n uc
le
ot
i d
e
b
as
es
t
of
o
rm h y d
ro
g
e
nb
o nd
s.P
r ob
e s a
re o
l i g
o
n uc
l
e o
t
i d
es
w h i
ch
b i
nd
, o rh
y
b
ri d iz e
,t o s
p
e ci fi
c, c om p l
em
e nt
a ry
s eq
u e n c e s of b
a s e sin
D N A
o rR
N
A
.S
e v e r al
h
y
b
ri d i
z at
io n
t
e ch
ni q
u e sw
h i
ch m
ak
e u s e of l
ab
ele
d p
ro
b
e
sh
a v eb
e
e nd
e v el
op
ed
.P
r ob
e sm
ay
b
el
ab
el
ed
w
i
t
h
r ad i
o a ct
i
vi
t
y
, c ol
o r ed
ag
e nt
s, o rfl
u o r e s c e nt
ag
e nt
s.A m
p l i fi
c at
io n
m
ak
e s u s e of
t
h
ep
ol y m
e r a s e ch
ai
n r e a ct
io n
(
P
C
R
)
t
op
r od
u c em
a ny
c op i
e s of
ap
i
e c e of
D N A i
n at
es
t t
ub
e
.I
nP C R
,t w
o
sh
o
rt
o
l i g
o
n uc
l
e o
t
i d
e
p
ri m
e r s ar
ea
d d
e
d i
ng
re a
t
e
xc e s s
t
o as a
m p l
e of
D
N A
.T
h
e n u cl
e ot
i d
e s eq
u e n c e of b
ot
h
e nd
s of
th
et
a rk
n ow
ni
n o rd
e rt
od
e
ve
l
o
p
P C R
p
ri m
e
r s.P
ri m
e r sf
o
rt
h
e rR
N
A
g
e n em
ay
b
ed
e si
g
n ed
t
ota r
g
et
ab
r oa
d
g
r o up
of
o rg
a ni
sm
s o r am
o r e sp
ec
i fi
cg
r o up
of
o rg
a ni
sm
s,p
o s si b l
y
a si
ng
l
es
p
e ci
e s,b
y
t
a rg
et
i
ng
h i
g
h l
y
c o n s e r v ed
o rh i
g
h l
y
v a ri
ab l
e
r eg i
o n so
f
t
h
e rR N A
g
e n e,r e s
p
e
ct
i
v el
y
.T
h
ep
ri m
e r sb i
nd
to
c om
p
l
em
e nta r
y
r eg
i
o n so
f
D
N A
a nd
p
r o vi d
e a st
a rt
i
ng
p
oi
nt
f
o r e xte
n si
o
no
f
t
h
e
D N A b
y t
h
e
e n zy m
eD N A p
ol
y
m
e r a s e.A f
t
e
r2 0
t
o3 0
cy
cl
e
s of
P C R
,a
10
^
-to
10
^-f
ol d i
n c r e a s e
i
nt
h
eta r
g
et
e
d
s eg m
e nt
of D N A
i
so
b
t
ai
n ed
.A ft
e
ra
m p l i fi
c at
i
o nb y
P
C R
,t
h
e
r e s ul
t
i
ng
p
r od
u ct
D N A
c a nb
e s ub
j
e ct
ed
t
o am
ul
t
i
t
ud
e of
m
ol
e c ul
a r a s s ay
s.S
om
em
i
c r ob i
al
c om m
u ni
t
y
a n al
y
si
sto o
l
s u s ed i
nw
a st
ew
ate r
e ng
i
n e e ri
ng
to
d
ate
h
a ve
b
e e nfl
u o r e s c e nt
i
n-s
i
t
uh y b
ri d i
za
t
i
o n(
F I
S
H
)
a nd
P
C
R
f
ol l
ow
ed b
y
d
e n atu r a n
t g
r ad i
e nt
g
el
el
e ct
r op h
o re
si
s(
D
G G E
)
,t
em p
e r atu r e
g
r ad i
e nt
g
el
el
e ctr o
p
h
o r e si
s(
T G G
E
)
, o rt
e rm i
n al
r
e st
ri
c
fi
o
nfr
ag m
e nt
l
e
ng
t
h p
ol y m
o rp h i
sm
(
t
-R F L
P
)
F
I
SH
m
a
k
e
s u s e of fl
u o r e s ce
nt
l y
l
ab
el
ed
ol i
g
o n u cl
e ot
i d
ep
r ob
es
t
od
et
e ct
sp
e ci fi
cg
r o up
so
f
o rg
a ni
sm
si
ni
nt
a
ct
m i
c r ob i
a
l
c o
m m
u ni
t
i
e s,t
h
u s sh
ow
i
ng
sp
at
i
al
r el
at i
o n sh i
p
sb
et
w
e e nd i f f
e r e nt
o rg
a ni
sm
si
nm i
c r ob i
al
c
om
m
u ni
t
i
e sw i
t
h
t
h
ep
ote
nt
i
a
l f
o r e n um
e r at
i
ng
t
h
o s e o rg
a ni
sm
si
n a s am p l
e.F I SH
r eq
ui
re
sa
p
ri
o ri
k
n ow l
ed g
e of
a
n o rg
a ni
sm
'sg
e n e s eq
u e n ce
i f
ag
e
n e of
t
h
at
sp
e
ci fi
co r
g
a n
i
s
m i
st
ob
ei
n v es
fi g
a
t
ed
.D G G
E
,T G G E
, a nd
t
-
R F
L P
a r e u s u al l
y
u s ed i
n n o n-s
p
e ci fi
c e v al
u at
i
o n s of m i
c r ob i
al
c o
m m
u ni
t
i
e s, u nl i k
eF I
S
H
,w
h i
ch
i
s u s ed
t
oi
n v e st
i g
at
e sp
e ci fi
c o rg
a ni
sm
s o rg
e n e sw
i
t h
i
n ac
om m
u ni
t y
.D G G E
(M
uy
z e r et
a
l.
,19 9 3
)
a
nd T G G E
(W
a
t
a n ab
e et
al
,19 9 8
)
p
r o vi d
e ac o
m m
u ni
t
y
"fi
ng
e rp
ri
nt
"(
a n al
og
o
u st
o a ch
r om
at
og
r am
)
o r r o ug h b
a si
sf
r om
w
h i
ch
t
oc o
m
p
a re
t
h
e
st
r u ct
u r ea
nd
e sti m
at
ed i
v e r si
t y
of m i
c r ob i
al
c om m
u ni
t
i
e s.I
nD G G E
o
rT
G G E
,o n e c o n s e r v e
d
r eg i
o nt
ot
h
e n e xt
.T
h
i
sd
o ub l
e
-s
t
r a nd
ed
P
C
R p
r od
u ct
i
st
h
e n s ub
j
e ct
ed
t
og
el
e
l
e ct
r op
h
o r e si
si
nw h
i
ch
ad
e n at
u r a nt
g
r ad i
e nt
i
s e st
ab
l
i
sh
ed
ei
t
h
e r ch
em i
c al l y
(
D
G G E
)
o rb
y
i
n c r e a si
ng
t
em
p
e r at
u r e(
T
G G
E
)
a c r o s st
h
eg
el
.I d
e al l
y
,D
N
A
am
p
l i f
i ed fr
om
d i f f
e r e nt
o r
g
a ni
sm
sw
i ll
d
e n at
u r e(
s ep
a r at
e)
at
d i f f
e r e nt
l
o c at
i
o n s al
o ng
th
eg
r ad
i
e nt
d
u et
od i f f
e r e n c e si
n at
t
r a ct
i
v ef
o r c e sk
e ep
i
ng t
h
eD N A d
o ub l
e-st
r a nd
ed
.
W
h
e nt
h
eD
N A d
e n at
u r e si
t
r em
ai
n sa
t
o n ep
o si
t
i
o ni
nth
eg
el
a nd
ab
a nd
of
D
N A f
o rm
s.T
h
el
o c at
i
o n a nd
,t
o s om
ed
eg
r e e,t
h
ei
nt
e n sit
y
of d i f f
e r e nt
b
a nd
si
nt
h
eg
el i
nd i
c at
eth
ed i
v e r si
t
y
a nd
st
r u ct
u r e of
t
h
em i
c r ob i
al
c
o
m m
u ni
t
y
.A
n ot
h
e r co
m m
u ni
t y
fi
ng
e rp
ri
nt
i
ng
t
e ch
ni
q
u ei
st
-R F
L P
(
L i
u et
a
l
.
,
19 9 7
)
.I
nt
-
R F L
P
,
o n e
P
C
R p
ri m
e ri
sl
ab
el
ed w
i
t
h f l
u o r e s c e nt
d
y
e.A ft
e rt
h
eP
C
R
i
sp
e rf
o rm
ed
,th
ep
r od
u ct
i
sd i g
e st
ed w i
t
h
r e st
ri
ct
i
o n e n zy
m
e sw h i
ch
c ut
t
h
eD N
A
at
sp
e ci fi
c n uc
l
e ot
i d
e s eq
u e n c es
.T
h
et
e
rm i
n al
r e st
ri
cti
o nf
r ag m
e nt
s(
t
-R F
)
c a nb
ed i
st
i
ng
ui
sh
ed fr
om
oth
e r r e st
ri
cti
o nf
r ag m
e nt
sb
y
'
^^
t
h
ed
et
e ct
i
o n of f
l
u o r e s c e n c e, a nd
th
el
e ng
t
h
s of
t
-R
F
s c a nb
ed
et
e rm i
n ed b
y
p
ol y
a c ry
l
am i d
eg
e
l
e
l
e ct
r op h
o r e si
s
.A
m p l i fi
ed g
e
ne
s of d i ff
e
ri
ng
s e
q
u e nc e
a r el i k
e
l y
to
p
r od
u c e at
-
R F
of
d i f f
e ri
ng
l
e ng
t
h
C
o n s eq
u e nt
l
y
, a n e sti m
at
e of
c om m
u ni
t y
d i
v e r si
t y
c a nb
em
ad
e a nd
m
ul
t
i p
l
e c om m
u ni
t
i
e s c a nb
e c om p
a r ed f
o r st
r u ct
u r al
si m i l
a ri
t
y
w
i
t
h
t
-R
F L P
fi
ng
e rp
ri
nt
i
ng
.I
n ad d i
t
i
o nt
o c om
p
a ri
ng
m i
c r ob i
al
c om m
u nit
i
e s o ri d
e nt
i fy i
ng
o rg
a ni
sm
sw
it
h i
nth
e
s e c om m
u nit
i
e s, c ul
t
u r e -i
nd
ep
e nd
e nt
m
ol
e c ul
a ra
s s ay
s c a nb
e us
ed
t
ot
a rg
et
fi
a n ct
i
o n al
g
e n es
.T
h
e s ef
u nc
t
i
o n al
g
e n e s a r em
o st
c om m
o
nl
y
k
n ow
nf
r om
i
s ol
ati
o n a nd
c
h
a r a ct
e ri
z at
i
o n of
ap
u r e c ul
t
u r et
ob
e r e sp
o n si b
l
ef
o r a sp
e ci fi
cb i
o ch
em i
c al
p
r o c e s s.H
o
w
e v e r ,th
e e n vi
r o nm
e nt
of
s u ch i
s ol
at
e si
s of
t
e nd
r a st
i
c al l
y
d i f f
e r e nt
f
r om
a nd
si m
p
l
e rth
a
nt
h
at
w h i
ch
i
s e n c o u nt
e r ed i
n c om p l
e xs
y
st
e
m
s s u ch
a
s s oi l
o r a ct
i
v at
ed
sl
ud g
e.i
nf
o rm
at
i
o n of
th
at
m
i
cro org
ani
sm
's r ol
ei
nth
em
or e com
p
l
ex nat
ur al
e n vi
ro nm
e nt
n ore x
c
lu
d
et
h
e
p
os s
i b i l i
t
y
t
h
at o
t
h
e rf l
i n ct
i
o n al g
e
n e sa
r e re
sp
o n si b le
f
o rt
h
e s am
eb i
o ch
em i
c al
o
p
e
r at
io n
i
n si t
u .B
ot
h
c ul
t
u r ed
a nd
u n c ul
t
u r ed m ic r o
b
e sm
ay
b
ei d
e nt
i f
i ed
a nd
e n um
e r at
ed
u si
ng
h
y
b
ri d i
z at
i
o nt
e ch
ni
q
u e s s u ch
a sF I
SH
(
G i
o v a n n o ni
et
al
.,19 8 8
;
M
ot
e r a nd G
ob
el
,2
0
0
0
)
o ra
m
p
l i f
i c at
i
o nt
e ch
ni
q
u e s s u ch
a s aq
u a nt
i
t
at
iv e
p
ol
y
m
e r a s e ch
ai
n r e a ct
i
o n(
q P
C R
) (
B
el l
e r et
a
l
.,2 0 0 2
)
.B
ut
i d
e nt
i f
i c at
i
o
n of
t
h
e
se
o rg
a
ni
s
m
sin
t
h
e e n vi
r o nm
e nt
n ei
t
h
e rp
r o vi d
e s ad i
re
ct
l i
nk b
et
w
e
e nt
h
o s
e o rg
a ni
sm
sa
nd
a sp
e ci f
i cb i
o ch
em i
c al p
r o c e s s s u ch
a sm
et a
b
ol i
s
m
of
at
a rg
et
c om
p
o u nd
, n o rd
o es
i
t
e
x clu
d
et
h
ep
o s si b i l i
t y
t
h
at
u n c ul
t
u r ed
a nd
u n ch
a r a ct
e ri
z ed
o r
g
a ni
sm
sm
ay
b
e r e sp
o n si b l
ef
o rt
h
e s am
ep
r o c e s sin
t
h
e c om
p
l
e x sy
st
em
.F
o r e x am
p
l
e ,W
h i
t
el
ey
a nd
B
ai l
ey
(W
h i
t
ele
y
a nd
B
a
i l
ey
,2
0 0 0
)
u s ed
F
I S
H
t
o e n um
e
r at
ea
-,
P
-, a n
d
y
-P
r o
t
e ob
a ct
e ri
aa
nd C
y
t
op h
ag
a-F la v o
b
a c
t
e ri
um
a nd
u s ed
D
G G E
t
o ob
t
ai
nt
ot
al
co
m m
u ni
t y
f
i ng
e rp
rin
t
sw
i
t
h i
n a ni
nd
u st
ri
a
l
a ct
i
v at
ed
sl
ud g
e sy
st
em
us
ed
t
ot
re a
t
p h
e
no
l i
cw
a
st
e
w
at
e
r .W
h i le
e n um
e r at
i
o n of
t
h
e s eg
r o up
s a nd
a n at t
em
p
t
t
o c o r r el
at
e ch
a ng
e sin
t
h
eb
a ct
e ri
al
c o
m m
u ni
t y
st
r u ct
u r et
o ch
a ng
e
sin
op
e r at
in
g
c o nd i
t
i
o n sw
i
t
h i
nt
h
et
r e at
m
e nt p
r o c e s si
su s
e
f
ul
, n od
e
f
i ni
t
i
ve
l i
nk b
et
w
e
e nt
h
eb
ac
t
e ri
al
c om m
u ni
t
ie s a n
d
p
h
e n ol d
eg
r ad
at
i
o n c a nb
em
ad
ef
r om
s u ch
a st
ud
y
.W
a t
a na
b
e
et
al
.( W
at
a
n ab
e
e
t
a
l
.,
19 9 8
)
e xp l
o r ed
t
h
e ef fe c
t
s of i
s ol
at
i
o nm
et
h
od
s,i
n clu
d
i
ng
b
at
ch
c ul
t
u re
e n ri
ch m
e nt
a nd
ch
em
o st
at
e n ric
h m
e nt
of
am
u ni
ci
p
al
a ct
i
v at
ed
sl
ud
g
ew
h i
ch h
ad b
e e n a c cl i m
at
ed
t
op
h
e n ol
, o nt
h
e s ele c
t
i
o n of 16
s rR N A
g
e n e s a nd f
u n ct
io n a
l
g
e n e sf
o
rt
h
e
la r
g
e st
s ub
u ni
t
of m
ul
t
i
c om p
o n e nt
p
h
e n ol h
y
d
r o xy l
a s es
(
L
m
P H
)
b
y
u si
ng
ac o
m b i
n at
io n
of
t
em p
e
r at
u r eg
r ad ie n
t
g
el
el
e ct
r op h
o r e sis
(
T
G G E
)
a nd
s eq
u e nc
in
g
of
P
C R
f
i ng
e rp
ri
nt
o v e rt
h
ep
e rio
d
of h i g h
s el
e ct
io
n
p
r e s s u r ef
o rp
h
en
ol d
eg
r ad
e r sm
i g h
t
i
n
d ic a
t
e
t
h
at
th
at
g
e n eb
el
o ng
sto
ap
h
e n ol
-d
eg
r ad i
ng
o rg
a nis
m
,t
h
e r ei
s n ot
d ir e c
t
e vi d
e n c eth
at
t
h
eo r
g
a ni
sm w
a sd
eg
r ad i
ng
p
h
e n ol i
nt
h
e a ct
iv a
t
ed
sl
ud
g
e c om m
u ni
t
y
.A d d i
ti
o n al l
y
, ot
h
e rfu n c
t
i
o n al g
e n e sm
ay
b
e r e sp
o n si b l
ef
o rp
h
e n ol d
eg
r ad
at
io n
.T
h
i
s c o ul d h
a v eb
e e n af
a ct
o rth
at
c o nt
ri b
ut
ed
t
ot
h
el
a ck
of
am p l i f
i c at
io n
of
a nL m PH g
e n ein
10
of 2 7 i
s ol
ate s
.A m
et
h
od
olo
g i
c al
ap p
r o a ch
t
oi d
e nt
i
fy
f
t i n ct
i
o
n al l y
r el
e v a nt
o rg
a ni
sm
sf
r om
c om
p
l
e xc o
m m
u nit
i
e st
h
at
cir c u
m
v e nt
st
h
e n e ed
t
o c ul
t
u r ei
s ol
ate s
i
s st
ab l
ei
s ot o
p
ep
r ob i
ng
(
SI P
)
.I
nS
I P
, am i
x ed
c ult
u r ei
sg
r ow
n o n ag
r ow t
h
s ub
st
r ate
l
ab
el
ed
w
i
th
a st
a
b l
e, n o n-r a
d io a c
ti
v eis o
to
p
e(
s u ch
a s ' ^C
)
w h i
ch
o c c u r si
nfr e
q
u e nt
l
y
in
n atu r a
l
s am
p
l
e s.T
h
em i
c r ob
e st
h
at
uti l i
z eth
e "h
e a vy
"i
s ot
op
e-l
ab
el
ed
s ub
str a
t
ein c o r
p
o r at
e s om
e of
t
h
eh
e a vy
is o
to
p
ein
t
ot
h
eir
c el l
s,in c
l
ud in
g m
a c ro
m
ol
e c ul
a rb io
m
a rk
e r s s u ch
a sD N A
,R N A
, a nd
p
ol
a rl i
p
i d f
at t
y
a ci d
s.L
ab
el i
ng
of
th
e s em
ole c u
le s
w
it
h
th
eh
e a vy i
s ot
op
et
h
e r ef
o r ep
r o vi d
e s ad ir e c
t
l i
nk b
et w
e e nth
e st
r u ct
u r e(
p
h
y
lo
t
y p
e)
a nd f
u n ct
io n
(
p
h
e n ot
y p
e)
of
th
em ic r o o r
g
a nis
m
s.T
h
el
ab
el
ed
m
a c r om
ol
e c ul
e s c a nb
e s ep
a
ra
t
ed fr
om
u nla
b
ele
d m
a c r om
o
l
e c ul
e sb
y
d
e n sit
y
g
r ad i
e nt
c e n
t
ri f
ug
at
io n
(
R
ad
aj
ew
sk i
et
al.
,2 0 0 0
)
o ri d
e nti f
i ed
w
i
th
o ut
s ep
a r at
io
nb
y
s e c o nd
a ry
i
o nm
a s s sp
e ctr o
m
etr
y
(
O
rp h
a n et
al
.,2 0 0 1
)
o ri
s ot
op
e r ati
om
a s ss
p
e ct
r om
et
ry
(
B
o s ch k
e r et
a
l
.,19 9 8
)
.T h
e u se o
f SI
P
,
p
a rt
i
c ula r
l y D N A
-
SI P
a nd R N A
-S
IP
,
h
a
sg
re
at
p
ot
e nt
i
al
t
o ad
v a nc e
o u r
k
n ow
le
d
g
e of
th
em ic r o
b i
al
e c ol
og y
of b io
l
og
i
c al
tr e a
tm
e nt
p
r o c e s s e s(
M
a n ef
i el
d
et
al
,2 0 0
4
)
.T
od
ate
,th
e v a ri
ab
l
e st
h
at
c a nin
f
lu e n c e
t
h
e o utc o
m
e s of SI P
e xp
e ri m
e nt
sh
a v e n ot
b
e e nf i
il l y
e xp l
o r ed
.T h
ep
ri m
a ry
ob
j
e ct
iv e
of
t
h i
s st
ud y
w
a st
o e va
l
u at e
t
h
e ef f
e cts
o
f
d i f f
e r e n c e sin
in
c ub
at
io
n c o nd i
t
i
o n s o nth
ei d
e nt
i f
i c at
i
o
n of p h
e no
l
-d
e