A Specification for Energy Allocation Calculation

Con el fin de realizar experimentos exploratorios de cristalización de la enzima para dilucidar su interacción con los péptidos inhibitorios, generamos también una TryR sin tags.

Los tags pueden ser secuencias peptídicas pequeñas (HIS-tag, FLAG-tag, T7-tag) o fragmentos de proteínas (MBP, GST) que facilitan la purificación, seguimiento y detección de las proteínas recombinantes. Las secuencias codificantes para estos tags se encuentran integradas en los vectores de expresión comerciales, con lo que los genes clonados, una vez traducidos, incorporaran estas secuencias de aminoácidos. Aunque no suelen interferir con el rol biológico de las proteínas sometidas a estudio e incluso en algunos casos pueden incrementar la solubilidad de la proteína de interés, en los estudios de biología estructural es preferible prescindir de los tags para evitar problemas en la formación de los cristales (259).

La TryR se encuentra clonada en el plásmido comercial pRSET A (pRSET A TryR H) y presenta en su extremo amino terminal un tag HIS que es usado para la purificación de la proteína por cromatografía de afinidad y para la detección de la misma usando anticuerpos

a-HIS.

Existen diferentes proteasas disponibles que pueden escindir los tags, como es el caso de la enteropeptidasa, la trombina y el factor Xa. Estas enzimas, sin embargo, según el sustrato pueden tener un comportamiento promiscuo. La proteasa TEV (del virus mosaico del

tabaco) y la proteasa del rinovirus 3c, son alternativas que no presentan el problema de especificidad antes mencionado y que además pueden funcionar a altas concentraciones de sal (1M de NaCl) y bajas temperaturas (4ºC). Sin embargo, son difíciles de producir en el laboratorio de manera recombinante debido a su baja solubilidad (260). Este problema puede solucionarse mediante la fusión de estas proteínas a la Glutatión S Tranferasa (GST). Tras expresar ambas proteasas virales, decidimos utilizar la proteasa del rinovirus 3c fusionada a GST dado que nos permitía alcanzar una producción más alta de enzima.

Tras una ronda de clonación, la secuencia codificante para el reconocimiento y corte por parte de la proteasa del rhinovirus 3c (LEVLFQG ↓ P) se insertó en el plásmido pRSET A TryR H curso abajo de la secuencia codificante de HIS y justo antes del codón de inicio de la TryR.

4.2.2.1 Escisión del tag HIS de la TryR

Debido a que todas las proteínas presentan diferentes configuraciones y no es posible predecir la accesibilidad de la secuencia de reconocimiento a la proteasa, las condiciones de digestión, en lo referente a la proporción sustrato/proteasa (Tripanotión reductasa /Proteasa del rinovirus 3c) deben de ser establecidas empíricamente.

En la Figura 4.7 se muestran los resultados de la digestión de diferentes proporciones sustrato/proteasa. Inicialmente se partió de 1 µg de sustrato junto a 1 µg de proteasa (1:1), disminuyendo progresivamente las proporciones de proteasa por un factor de 10 hasta llegar hasta 1µg de TryR y 1 ng de proteasa (1:1000). La TryR antes de la escisión del tag y con la secuencia de reconocimiento de corte tiene un peso molecular de 58 kDa, transformándose en una proteína de 53 kDa tras el corte. Por su parte, la proteasa fusionada a GST tiene un tamaño de 46 kDa. Como se observa en la Figura 4.7 A, en las proporciones 1:1 y 1:10 (líneas 1 y 2) toda la TryR ha perdido la cola de histidinas observándose solo la especie de 53 kDa (además de la proteasa a 46 kDa). Los resultados obtenidos tras el western blot utilizando anticuerpos a-HIS muestran la ausencia del HIS-tag en la proteína presente en las líneas 1 y 2, lo que demuestra que se ha alcanzado una digestión completa (Figura 4.7 B).

Figura 4.7 | Digestión de la TryR con la Proteasa del Rhinovirus 3C. A) SDS-PAGE teñido con Coomassie, B) Western-Blot Anti-HIS. MW. Marcador de peso molecular. Relaciones (masa/masa) entre sustrato y proteasa: Línea 1= 1:1; Línea 2= 1:10; Línea 3= 1:100; Línea 4= 1:1000; Línea 5= sólo sustrato (1µg); Línea 6= sólo Proteasa (1µg).

Tras el corte de la enzima con la proteasa es necesario realizar una nueva cromatografía para eliminar tanto la proteasa como las colas de HIS escindidas. Para esto se realiza un proceso de cromatografía de afinidad mixto en el cual se usa una columna con glutatión (unión de la GST-proteasa) acoplada a otra con Ni-NTA (unión de la cola HIS escindida). El producto de la digestión se hace recircular en un sistema cerrado, de manera que la proteasa y los fragmentos que contienen las colas de HIS quedan retenidos en las columnas de glutatión y de Ni-NTA respectivamente, obteniéndose la TryR escindida pura y sin necesidad de un paso extra de elución. Este proceso adicional de cromatografía elimina por completo la banda de 71 kDa que todavía contaminaba nuestra muestra tras la cromatografía de intercambio iónico, obteniéndose finalmente una proteína con un grado de pureza de >99%, según nuestros análisis de densitometría. Ensayos de actividad enzimática demostraron la misma actividad específica independientemente de la presencia o ausencia del tag HIS en la proteína.

4.2.2.2 Cristales de TryR

Los ensayos de cristalización fueron realizados por el equipo del Prof. Juan Hermoso en el Instituto de Química Física Rocasolano (CSIC). Tras realizar un muestreo masivo de condiciones de cristalización se obtuvieron cristales de buen tamaño y a los 7 días en presencia de 2M de sulfato de amonio, 0.1 M de Tris pH 8.5, y 5% de PEG 400 (Figura 4.8).

Figura 4.8 | Cristal de TryR sin HIS-tag obtenido tras 7 días en el tampón de cristalización.