Data Design

Por definición, un farmacóforo es el conjunto de características electrónicas y estéricas que son necesarias en una molécula para asegurar una interacción supramolecular óptima con una diana biológica específica, desencadenando (o bloqueando) en consecuencia la respuesta biológica evocada por la misma.

Con el fin de obtener un modelo farmacofórico de la interacción de los péptidos inhibitorios con la TryR, se tuvieron en cuenta los siguientes resultados experimentales:

• El cambio E2K en el péptido 3 (TRL14) aumenta su potencia inhibitoria (Figura 4.20).

• El scanning de alanina muestra la gran relevancia que presenta el residuo Q5 en la potencia del péptido (Figura 4.26).

• El estudio de los péptidos truncados demuestra la necesidad de que la isoleucina 9 (I9) esté presente en el péptido (TRL38) (Figura 4.27).

Con estos datos nuestro grupo desarrolló un modelo de farmacóforo para definir de forma simplificada la interacción entre TRL38 y el monómero de TryR (Figura 4.41 A). Este modelo describe 3 interacciones importantes: i) una interacción electrostática entre la cadena lateral de K2 y los carboxilatos del residuo clave E436’ y el D432’ del monómero; ii) un bolsillo donde se ubica la cadena lateral de Q5, que interacciona mediante enlaces de hidrógeno con el esqueleto polipeptídico de I458’ y V460’ (Figura 4.41 A-B); iii) una interacción hidrófoba entre I9 y F454’. Los residuos Q5 e I9 se encuentran a una distancia de 6.1 Å, mientras que K2 está a 12 Å de Q5 y a 15.2 Å de I9 (Figura 4.41 D).

4.7.1 Uso del Farmacóforo para la Identificación de Moléculas Pequeñas con

Capacidad Inhibitoria de TryR

Una vez establecidos los residuos clave para la interacción entre el péptido inhibidor y la TryR (K2, G5 e I9), se realizó un cribado virtual empleando el programa CRDOCK implementado en la plataforma VSDMIP (272).

El cribado virtual se realizó a partir de >200 000 moléculas pertenecientes a la base de datos del National Cancer Institute (NCI) y del Instituto de Química Medica (IQM) del CSIC. Se obtuvieron unas 100 moléculas cuyas poses de docking fueron inspeccionadas visualmente, eligiéndose 17 moléculas para su estudio biológico, 5 procedentes del NCI y 12 del IQM.

Figura 4.41 | Modelo de interacción de TRL38 con la interfaz de dimerización de un monómero de TryR y modelo de farmacóforo. A. Vista de la interacción de la región amino-terminal de TRL38 con la interfaz de dimerización de un monómero de TryR. En azul K2 que interacciona con D432’ o E436’ de TryR; en verde Q5 que interacciona con I458’ y V460, B. Otra vista de la misma interacción en el que se muestra el extremo carboxilo del TRL38 y la interacción de I9 con F454’ de TryR. C. Secuencia y estructura de TRL38. Se muestran las cadenas laterales de los residuos de interés K2, Q5 e I9., D. Modelo de farmacóforo propuesto.

Figura 4.42 | Moléculas pequeñas con potencial inhibitorio derivadas del cribado virtual y pertenecientes a la base de datos del IQM.

De las moléculas que eran solubles en un medio acuoso y lograron ser evaluadas a 25 µM (Figura 4.42), solo TRL66, TRL69 y TRL70 mostraron actividad inhibidora: (Figura 4.43), la cual fue caracterizada en mayor detalle en los ensayos enzimáticos y de dimerización.

Figura 4.43 | Ensayo de actividad de las moléculas pequeñas seleccionadas a partir del cribado virtual. Todos los compuestos se evaluaron a una concentración de 25 µM. Además de los controles (mepacrina y TRL14), solo TRL66, TRL69 y TRL70 tienen capacidad inhibitoria de la actividad de TryR.

El ensayo enzimático (Figura 4.44) reveló que TRL69 es la molécula que presenta la mayor actividad inhibitoria, si bien su valor de CI50 es todavía muy superior al del péptido prototipo.

definido como base para un cribado virtual y constituyen un pequeño paso en la dirección correcta hacia la síntesis de moléculas de naturaleza no peptídica con actividad leishmanicida diseñadas de manera racional.

Figura 4.44 | Actividad inhibidora de TryR de TRL 66, TRL69 y TRL70.

Con respecto a los ensayos de dimerización (Figura 4.45), los resultados obtenidos no se corresponden con lo esperado. De manera sorprendente, un aumento de las concentraciones de estos compuestos se asocia a un aumento en las tasas de dimerización (Figura 4.45 A, B y C)

Para entender este resultado hay que tener en cuenta que las enzimas, tras ser diluidas e incubadas por periodos de tiempo prolongados, van perdiendo actividad de manera paulatina. En nuestro laboratorio hemos comprobado que la incubación de 400 nM de TryR a 37 ºC durante 16 horas conlleva una pérdida de entre el 40 y el 45% de actividad, lo que se puede extrapolar a una pérdida de más del 40% de la forma dimérica. Tras la incubación con TRL66, 69 y 70 se muestra un aumento en la presencia de dímero de hasta un 160, 130 y 182% respectivamente (Figura 4.45), lo que nos lleva a pensar que estas moléculas se comportan como potentes estabilizadores de la TryR dimérica, dificultando la disociación natural de dímeros a monómeros que sufre la enzima tras ser diluida e incubada. Es de destacar que, en su presencia, se obtienen valores superiores al 100% de dímero con respecto al control en ausencia de tratamiento.

Este resultado, a pesar de ser difícil de interpretar a priori, sugiere que nuestras moléculas pueden establecer interacción con ambas subunidades de TryR, aunque dichas interacciones no necesariamente estén localizadas en la interfaz de dimerización objeto de nuestro estudio.

En nuestro modelo de inhibición de la actividad y desestabilización del dímero, el péptido se asocia con la interfaz de dimerización de una de las subunidades impidiendo su unión con la otra. Por este motivo sospechamos que el efecto de inhibición de estas moléculas no peptídicas podría deberse a una interacción en el sitio activo de la enzima, constituido por residuos procedentes de ambas subunidades, en lugar del inicialmente propuesto en la interfaz. Para evaluar nuestra hipótesis, realizamos un ensayo de dimerización usando TRL69 y, como competidor por el sitio activo, mepacrina. Como se observa en la Figura 4.45 D, al añadir mepacrina al ensayo de dimerización el efecto de estabilización de TRL69 desaparece, lo que apoya la hipótesis de que estas moléculas se ubican en el sitio activo de la enzima.

Figura 4.45 | Ensayo de dimerización de TryR tras la incubación por 16 horas con diferentes concentraciones (9.4 µM – 75 µM) de A. TRL66, B. TRL69 y C. TRL70. D. Ensayo de competición entre TRL69 (9.4 µM – 75 µM) y mepacrina (75 µM).