4.5.1
Inhibición de la TryR silvestre en lisados de promastigotes deL.
infantum
Una vez establecida la capacidad de nuestro prototipo TRL35 para inhibir la TryR de L. infantum expresada y purificada a partir de bacterias, consideramos relevante comprobar también su capacidad para inhibir la TryR silvestre presente un extracto de promastigotes de
L. infantum.
Para ello se puso a punto el ensayo desarrollado por van den Bogaart et al. que adapta la reacción acoplada a DTNB ya descrita para su uso en aquellas situaciones en las que la TryR proviene de extractos celulares (247). Como se aprecia en la Figura 4.31 A, si bien TRL35 a una concentración de 25 µM (o) es capaz de reducir la actividad TryR presente en el extracto de promastigotes, esta inhibición no es tan pronunciada como la observada en un ensayo de actividad estándar sobre TryR recombinante (Figura 4.31 C). La comparación de los dos ensayos revela dos posibles causas de este peor comportamiento del péptido: i) la presencia de múltiples macromoléculas en el extracto celular que, mediante interacciones inespecíficas, puedan disminuir la concentración efectiva de péptido disponible y ii) las diferentes composiciones de los tampones de ensayo. El posible efecto de la diferente composición de los tampones se evaluó comparando la capacidad inhibitoria de TRL35 sobre TryR recombinante en ambas condiciones de ensayo (Figuras 4.31 B y C). Como se puede apreciar, el tampón utilizado para la lisis de los parásitos tiene un efecto adverso en la capacidad del péptido de inhibir la enzima, efecto que presumiblemente puede ser atribuido a la presencia del detergente Tritón X-100. A pesar de que este debe ser el motivo fundamental del diferente comportamiento de TRL35 en ambos ensayos, no es completamente descartable el efecto de la unión inespecífica del péptido a las numerosas macromoléculas presentes en el extracto celular. En cualquier caso, este conjunto de experimentos avala la capacidad de TRL35 para inhibir la TryR presente en los parásitos.
Figura 4.31 |Inhibición de la TryR silvestre presente en lisados de parásitos por 25 µM de TRL35.A. Inhibición de la TryR silvestre en lisados. B. Inhibición de la TryR recombinante en tampón de lisis, C. Inhibición de la TryR recombinante en tampón de actividad (HEPES 40 mM)
4.5.2
Entrada del Péptido en amastigotes de L. major (in-cellulo)La capacidad del péptido 35 para penetrar en las células se evaluó mediante la unión de 5- isocianato de fluoresceína (FITC), una molécula fluorescente (l490ex, l525em) que permite el
seguimiento in cellulo del péptido mediante microscopia confocal. Esta versión modificada de TRL35 fue sintetizada por Peptide Protein Research y el FITC se agregó en el extremo amino- terminal usando un espaciador de poli-etilenglicol (PEG). Este péptido fue denominado TRL58 (Figura 4.32).
Figura 4.32 |Estructura del TRL58. Este péptido es un derivado del TRL35 y presenta una molécula de FITC y un espaciador PEG en el extremo amino-terminal.
Los experimentos de microscopía confocal fueron realizados durante una estancia predoctoral en el laboratorio del Dr. Ger van Zandbergen del Instituto Paul Ehrlich (Alemania).
Tras realizar diversos ensayos a concentraciones de 75 µM y 25 µM, se determinó que este péptido, a altas concentraciones, tiene tendencia a formar precipitados fluorescentes que iluminan todo el campo tras la excitación de la muestra e impiden por lo tanto la obtención de una imagen clara. Se decidió entonces que la concentración de 5 µM es la más idónea para realizar estos experimentos, ya que concentraciones menores generan una fluorescencia muy tenue.
En la Figura 4.33, se observa una imagen en dos planos confocales distintos de macrófagos tratados con 5 µM de TRL58 durante 16 horas. Tras el tratamiento, las células se lavan para eliminar el exceso de péptido y se tiñen con CellMask™ DeepRed (ThermoFisher Scientific), que tiñe de manera rápida y homogénea las membranas plasmáticas, permitiendo determinar la localización intracelular o extracelular de la fluorescencia. En la Figura 4.33 A se observa en verde el péptido TRL58. Al cambiar el plano confocal (Figura 4.33 B) se puede comprobar que estas estructuras verdes se localizan dentro de la célula. En la parte inferior izquierda de las imágenes puede apreciarse un precipitado extracelular de TRL58.
Figura 4.33 | Macrófagos marcados con CellMask DeepRed (rojo) e incubados con TRL58 (verde) a una concentración de 5 µM durante 16 h. Se muestran dos planos confocales del mismo campo. En B se aprecia que TRL58 se encuentra dentro del macrófago.
Las imágenes muestran claramente que TRL58 no está distribuido de manera homogénea en del citoplasma celular, sino que se encuentra en compartimentos discretos con apariencia vacuolar. Ello podría deberse a una fagocitación de los agregados peptídicos mencionados con anterioridad. Estos macrófagos también fueron usados para realizar experimentos de colocalización de los parásitos con el péptido. En este experimento, los macrófagos se
incubaron durante dos horas con amastigotes axénicos que expresan la proteína DsRed. Tras la incubación, los amastigotes no internalizados fueron eliminados mediante lavados. Posteriormente, los macrófagos se trataron con 5 µM de TRL58 durante 16 horas.
Como se observa en la Figura 4.34, que se corresponde a un campo representativo de los observados, dentro de la célula se aprecia de nuevo la emisión de fluorescencia verde (TRL58) compartimentalizada en vacuolas. En el macrófago de la derecha se observa la emisión de fluorescencia roja que indica la posición de los amastigotes intracelulares. Aunque observamos varias células infectadas que, a su vez, internalizaron TRL58, no logramos ver nunca colocalización del péptido y los parásitos, lo que indica que el péptido no llega hasta la ubicación intracelular en la que se encuentra el parásito a pesar de que sí se encuentra dentro del macrófago.
Figura 4.34 | Microscopía confocal de macrófagos infectados con amastigotes DsRed (rojo) y tratados con 5 µM de TRL58 durante 16 horas.
Estos resultados resaltan la dificultad que presenta la utilización de péptidos con la intención de inhibir proteínas pertenecientes a parásitos intracelulares y ponende manifiesto la necesidad de desarrollar péptidos unidos a secuencias transportadoras que faciliten la entrada de estos hasta los compartimentos donde son requeridos. Una solución alternativa es el desarrollo de moléculas pequeñas basadas en la estructura del péptido prototipo que puedan atravesar de manera más sencilla las diferentes membranas.