Con el objetivo de caracterizar molecularmente nuevos aislados del PRSV colectados en las principales zonas productoras del país, se procedió al aislamiento y secuenciación de los genes que codifican para la CP y HC-Pro del virus. Se utilizaron estos genes debido al valor de la secuencia de la CP en los estudios de taxonomía del virus, la participación de ambos genes durante el proceso de adquisición e infección del virus y las aplicaciones al manejo.
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Para ello se seleccionaron, además de los 23 nuevos aislados a los que se le evaluó la agresividad del PRSV en casas verdes, los aislados de Melena del Sur-2, Jagüey Grande-2, Santo Domingo-2, Puerto Padre-1, Calixto García y Campechuela. En estos aislados se comprobó la infección por el PRSV mediante la transmisión mecánica a plantas de papaya y la confirmación por RT-PCR a partir de muestras sintomáticas mantenidas a -80 °C, según se describe en el epígrafe 3.1.3. Se utilizó como controles negativos ARN de plantas de papaya sanas.
3.4.1 Amplificación por RT-PCR y purificación de los productos obtenidos
Para la amplificación del gen que codifica para la CP en aislados cubanos del PRSV se utilizaron los oligonucleótidos BoCP descritos en el epígrafe 3.1.3. Para la amplificación del gen que codifica para la HC-Pro se diseñaron los oligonucleótidos degenerados (HC2) (sentido 5’-AGYTCRCCMGAWATGGGA-3’ y reverso 5’-GGATTGTTCTAGCAAGCG- 3’) que amplifican la HC-Pro y parte de las regiones carboxilo y amino-terminal de los genes que codifican para P1 y P3, respectivamente. Para el diseño de los oligonucleótidos se utilizaron las secuencias completas del PRSV depositadas en la base de datos del
GenBank (S46722, AY231130, EF183499, EU126128, HQ424465, JX448371, JX448373,
NC_001785 y EF017707), y estas fueron procesadas a través del paquete bioinformático Lasergene 8.0.2 (DNASTAR, EE.UU.). En la figura 6 se observa la posición en el genoma del aislado PRSV HA (S46722), de los oligonucleótidos utilizados en esta investigación (Yeh et al., 1992).
Figura 6. Posición de los oligonucleótidos BoCP y HC2 en el genoma del Virus de la mancha anular de la papaya (aislado HA, Hawai).
Las condiciones para la amplificación del gen que codifica para la CP en aislados del PRSV se describen en el epígrafe 3.1.3. En la amplificación del gen que codifica para la HC-Pro del PRSV se utilizó el sistema comercial KAPA Hifi™ HotStart (Kapa Biosystem, EE.UU.). Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 25 L y para ello se usaron: 1 μL de ADNc, 0,25 mM MgCl2, tampón comercial KAPA 1x, 0,3 mM de cada
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Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador Mastercycler® personal
(Eppendorf, Alemania). Las condiciones para las reacciones incluyeron un ciclo inicial de 3 min a 95 °C, seguido por 40 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 46 °C durante 45 s, extensión a 72 °C durante 90 s, con una extensión final de 10 min a 72 °C. El producto de reacción fue sometido a una electroforesis en gel de agarosa al 1,2 %, la porción del gel que contenía la banda de interés se cortó y se procedió a la extracción del ADN mediante el QIAquick® Gel Extraction Kit (Qiagen, Alemania), según las recomendaciones del fabricante. Mediante electroforesis se verificó la calidad del producto purificado, usando 1 μL de los productos en gel de agarosa al 1% en tampón TBE 1x. Estos fueron teñidos con bromuro de etidio y se visualizaron bajo luz ultravioleta, según se describe en el epígrafe 3.1.3.
3.4.2 Clonaje del gen que codifica para la HC-Pro de aislados del PRSV
Para obtener las secuencias del gen que codifica para la HC-Pro del PRSV se realizó la clonación de los fragmentos de RT-PCR obtenidos a partir de muestras de los aislados Boyeros-2, Bejucal, Jagüey Grande-2 y Rafael Freyre. Para ello se utilizó el pGEM T® Easy Vector System I (3 015 pb) y la cepa de Escherichia coli JM109 (Promega, EE.UU.). Reacción de ligación y transformación de células competentes de E. coli
Para la ligación, el fragmento de ADN amplificado de cada aislado se sometió previamente a la adición de adenina en sus extremos con el uso de la enzima Top Taq™ ADN polimerasa (Qiagen, Alemania) y la reacción se incubó a 72 °C durante 10 min. En cada reacción de ligación se empleó 50 ng del vector plasmídico pGEM® T Easy y una cantidad del fragmento amplificado para una relación final banda:vector (3:1), en un volumen final de 10 μL. La reacción de ligación se llevó a cabo a 4 °C durante 1 h.
La transformación de células se realizó mediante el protocolo descrito por Sambrook y Russell (2001), para el cual las células competentes de E. coli se descongelaron en hielo y se tomaron 50 L, mezclándolas posteriormente con 2 L del producto de la reacción de ligación donde permanecieron durante 20 min y luego se sometió a un impacto térmico de 42 °C durante 50 s. Se colocó nuevamente en hielo por el mismo tiempo y posteriormente se adicionó 950 L de medio de cultivo Luria-Bertani (LB) líquido (triptona 0,01%,
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extracto de levadura 0,005%, NaCl 0,005%) (Sigma, EE.UU.), y se incubó a 37 °C durante 45 min en movimiento (1 500 rpm). Pasado este tiempo, se sembraron 100 L del producto de la transformación en placas de Petri. Las células transformadas se esparcieron, con una espátula de Drigalsky, sobre medio de cultivo LB sólido (triptona 0,01%, extracto de levadura 0,005%, NaCl 0,005%, agar 0,015%) (Sigma, EE.UU.) con ampicillina (100
g.mL-1), 16 L de X-Gal (5 bromo-4 cloro-3-indolil--D-galactósido) y 4 L de IPTG (isopropil-tio--D-galactósido). Posteriormente, se incubó a 37 °C durante toda la noche. Análisis de los clones recombinantes
La selección de los plasmidios recombinantes se realizó por su resistencia al antibiótico ampicillina, y a través del método de selección de colonias blancas y azules (Sambrook y Russell, 2001). Se verificó la incorporación del fragmento de interés mediante PCR de colonias, para lo cual se utilizaron los oligonucleótidos M13 y HC2. Para esto, las colonias de color blanco fueron diluidas en 20 L de agua estéril y se utilizó 1 L de esta dilución en cada reacción de PCR. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen final de 20 L y para ello se usaron: tampón comercial Go Taq 1x, 0,2 mM de cada dNTP, 0,4 μM de cada oligonucleótido y 1 U de GoTaq ADN polimerasa.
Las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador Mastercycler® personal
(Eppendorf, Alemania). Las condiciones para la realización de las reacciones con los oligonucleótidos M13 fueron de un ciclo a 95 °C durante 3 min y 35 ciclos a 94 °C durante 30 s, 61 °C durante 45 s y 72 °C durante 90 s, y para finalizar 72 °C durante 10 min. Con los oligonucleótidos HC2 se mantuvieron iguales las concentraciones finales de reactivos, pero la hibridación se realizó a 46 °C. El resultado de las reacciones se verificó por electroforesis en gel de agarosa al 1% en tampón TBE 1x. Los productos fueron teñidos en bromuro de etidio y visualizados bajo luz ultravioleta.
3.4.3 Secuenciación y análisis de las secuencias
La purificación de los plasmidios recombinantes se realizó mediante el Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega, EE.UU.), según las recomendaciones del fabricante. Los ADN plasmídicos conteniendo el gen que codifica para la HC-Pro fueron secuenciados en las facilidades disponibles en Macrogen (Corea del Sur) en un
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secuenciador automático ABI 3730xl (Applied Biosystems, EE.UU.). Se seleccionaron dos clones por cada aislado y fueron sujetos a una doble secuenciación a partir de ambos extremos (Sambrook y Russell, 2001). La secuenciación directa de las bandas de ADN purificadas correspondientes al gen que codifica para la CP se realizó con los oligonuclétidos BoCP, siguiendo el método descrito anteriormente.
Las secuencias obtenidas se ensamblaron en el programa Vector NTI (Invitrogen, EE.UU.). Para la búsqueda de homología en las bases de datos internacionales de las secuencias nucleotídicas de la CP y HC-Pro obtenidas se utilizó el programa Blastn (Altschul et al., 1990), disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Se empleó el programa Vector NTI (Invitrogen, EE.UU.) para la manipulación de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos. El alineamiento múltiple de los nucleótidos y aminoácidos se generaron en MUSCLE (Edgar, 2004) en el programa MEGA versión 5.2.2 (Tamura et al., 2011). Para el análisis filogenético se usó el método de unión con el vecino más cercano (neighbor-joining)con valores de remuestreo (bootstrap) de 1 000 (Saitou y Nei, 1987). En este análisis se incluyeron las secuencias obtenidas de los aislados mencionados en el epígrafe 3.4. Además, se incorporaron las secuencias de los aislados Santo Domingo-1 y Boyeros-1, caracterizados con anterioridad (Portal et al., 2006), y secuencias de Cuba, y del grupo América-Australia publicadas en el GenBank (Anexo 3).
Con el propósito de analizar los posibles sitios de recombinación en los genes que codifican para las proteínas CP y HC-Pro, de aislados cubanos del PRSV, se utilizó el programa RDP4 Beta 4.38 (del inglés: Recombination detection program) (Martin et al., 2010). Los análisis de los alineamientos de nucleótidos de ambos genes se realizaron, con los parámetros predeterminados, mediante la utilización de los métodos RDP (Martin y Rybicki, 2000), GENECONV (Padidam et al., 1999), BootScan (Martin et al., 2005), MaxChi (Smith, 1992), Chimaera (Posada y Crandall, 2002), SiScan (Gibbs et al., 2000), 3Seq (Boni et al., 2007) y LARD (solo para la HC-Pro) (Holmes et al., 1999) implementados en dicho programa. Se consideró como posible recombinante aquella secuencia respaldada por al menos tres de los métodos empleados.
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3.5 Tácticas para el manejo del PRSV en plantaciones de papaya var. Maradol roja