frutos con anillos concéntricos. Síntoma que abarca hasta el 25% del órgano afectado.
3
Síntoma generalizado: parches formados por áreas verde claro e intenso alternados en la superficie adaxial de las hojas, frutos con anillos concéntricos. Síntomas que alcanzan hasta el 50% del área de la planta.
4
Síntoma severo: mosaico esparcido en las hojas (mosaico acentuado), que alterna con zonas verdes. Inicio de deformación, zonas abultadas de color verde intenso (islas verdes) y frutos con anillos concéntricos. Síntomas que alcanzan entre el 51 y 75% del área de la planta.
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Síntoma muy severo: mosaico intenso causado por clorosis que cubre la totalidad de la hoja, reducción de la lámina foliar hasta la filiformidad, manchas de apariencia aceitosa bien definidas en la zona superior del tallo y en pecíolos. Anillos concéntricos en frutos. Síntomas que abarcan más del 75% del área de la planta.
El uso de una escala de evaluación del PRSV puede aplicarse en la implementación de tácticas de manejo en plantaciones comerciales (Hernández-Castro et al., 2004), en la selección de genotipos promisorios, en la detección presuntiva de la enfermedad en campo y para determinar la resistencia en líneas transgénicas de papaya (Davis et al., 2004). En Cuba, Rodríguez et al. (2013) evaluaron la respuesta al PRSV en accesiones cubanas de papaya y emplearon una escala evaluativa de 0-5 grados. No obstante, no evaluaron la variedad Maradol roja, y se realizó una descripción cuantitativa de la intensidad de síntomas en los órganos, sin describir los síntomas en cada grado.
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En la Florida, Crane et al. (1995) compararon el efecto del PRSV en cultivares y accesiones de papaya en condiciones de campo mediante una escala evaluativa de 0-5 grados. Se señalaron los síntomas generales del PRSV, pero no describieron el progreso de los mismos. Davis et al. (2004) utilizaron otra escala de 0-5 grados para evaluar la severidad de aislados del PRSV en cultivares de papaya, y señalaron la muerte de la planta como la máxima manifestación de los síntomas. En México, Hernández-Castro et al. (2003) realizaron un análisis epifitiológico de esta enfermedad y emplearon una escala de 1-6, con la muerte de la planta como el último valor de severidad. Posteriormente, Hernández-Castro
et al. (2010) utilizaron otra escala similar para evaluar tácticas de manejo del PRSV en plantas de papaya var. Maradol roja, pero destacaron como síntomas iniciales el ennegrecimiento, distorsión y aparición de manchas aceitosas en las nervaduras y coinciden con la muerte de la planta en el grado 6.
Algunos de los síntomas del PRSV referidos anteriormente no coinciden totalmente con la descripción del progreso de esta enfermedad en las plantaciones de papaya evaluadas en esta investigación. En Cuba, no se ha detectado la inducción de necrosis de nervaduras, ni muerte de la planta como resultado de la infección con este virus. Esta situación confirma lo mencionado por Purcifull et al. (1984) en cuanto a la sintomatología inducida por el PRSV, donde destacan la influencia de varios factores como la temperatura, condiciones de cultivo y aislados presentes.
En México, Noa-Carrazana et al. (2006) informaron la inducción de necrosis en hojas de papaya debido a la presencia de infecciones mixtas entre el PRSV y el PapMV, situación que hasta el momento no se presenta en Cuba. Sin embargo, se han detectado infecciones mixtas con fitoplasmas (Arocha et al., 2009), pero la necrosis de las hojas no se asocian a la expresión fenotípica de los síntomas del PRSV. En Cuba, se ha descrito la presencia del PANVasociado a necrosis en la zona apical de las plantas (Mejías et al., 1987). Además, se han señalado síntomas que incluyen la necrosis y una ligera deformación de las hojas producto de la presencia del cogollo arrepollado de la papaya, asociado a fitoplasmas (Arocha et al., 2003; Arocha et al., 2006). Por primera vez en Cuba, se propone una escala evaluativa para determinar la severidad de síntomas inducidos por el PRSV en la variedad Maradol roja, que es la más extendida en el país.
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4.1.2 Alteraciones causadas por el PRSV en el contenido de clorofilas en hojas de papaya
Al compararse la concentración de clorofilas entre hojas de plantas de papaya con síntomas evidentes del PRSV y plantas asintomáticas, en estas últimas siempre fue superior. Se observaron diferencias significativas en el contenido de clorofilas entre todos los síntomas evaluados y de estos con las plantas asintomáticas. La mayor reducción en el contenido de clorofilas se observó en las hojas con filiformidad, seguido de las hojas con mosaico intenso, mosaico acentuado, parches, mosaico ligero y clorosis internerval (Tabla 2). Estos resultados validan la agrupación de síntomas según su evolución en cada grado de la escala evaluativa elaborada.
Tabla 2. Contenido de clorofilas (a, b) en hojas de plantas de papaya var. Maradol roja con diferentes síntomas del Virus de la mancha anular de la papaya.
Grados Descripción Clorofila-a (µg/100mg) Clorofila-b (µg/100mg) Rangos promedio Medias reales Rangos promedio Medias reales 0 Asintomática 128,75ª 16,93 129,48a 5,06 1 Clorosis internerval 111,95b 14,47 110,73b 4,17 2 Mosaico ligero 90,25c 11,51 90,85c 3,31 3 Parches 70,55d 9,51 70,85d 2,63 4 Mosaico acentuado 51,00e 7,01 50,60e 2,02 5 Mosaico intenso 30,50f 4,81 30,50f 1,28 Distorsión de la hoja 10,50g 1,17 10,50g 0,35 Rangos promedio con letras desiguales en una columna difieren según Kruskal Wallis/Mann Whitney (p<0,05)
El efecto de la aparición de mosaicos en la reducción del contenido de clorofilas fue informado por Hull (2002), para enfermedades causadas por virus. Peterson y Mckinney (1938) concluyeron que la reducción de pigmentos en las hojas afectadas se debe a la estimulación de clorofilasas y alteración del desarrollo de los cloroplastos.
La reducción de clorofilas, como se observó en esta investigación, se informó en Phaseolus vulgaris L. Merrill y Glycine max L. como efecto de la infección con el Virus del mosaico amarillo del frijol (BYMV, del inglés: Bean yellow mosaic virus) (Chinnadurai y Nair, 1971) y el Virus del mosaico de la soya (SMV, del inglés: Soybean yellow mosaic virus) (Narayanasamy y Palaniswami, 1973). Resultados similares se informaron en plantas de
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papaya infectadas con aislados del PRSV (Rahman et al., 2008), pero no se establecen relaciones entre el contenido de los pigmentos y el progreso de los síntomas de la enfermedad.
En este ensayo se determinó el efecto que provoca el progreso de los síntomas del PRSV en la reducción del contenido de clorofilas en hojas de papaya. El contenido de clorofilas determinado para los síntomas descritos en el grado 5 de la enfermedad (mosaico intenso y filiformidad) mostró diferencias significativas entre ellos, pero se manifestaron de forma simultánea en las plantas infectadas. La escala elaborada puede ser empleada para evaluar la severidad de síntomas inducidos por el PRSV en plantaciones de papaya var. Maradol roja en Cuba, y determinar la efectividad de tácticas para el manejo de este virus.
4.1.3 Ocurrencia, prevalencia y severidad de síntomas inducidos por el PRSV
Como resultado del ELISA-DAS (datos no mostrados) en las plantas indicadoras inoculadas con aislados del PRSV y el análisis por RT-PCR de las hojas colectadas de plantas de papaya, se detectó la presencia del PRSV en 13 de las 15 provincias en que Cuba se encuentra dividida. La enfermedad causada por este virus se identificó en 36/69 localidades, comprendidas en 30 de los 47 municipios visitados, lo que representa una ocurrencia del 52,17%. De los 111 puntos o plantaciones de papaya inspeccionadas, en 55 de ellos se obtuvo productos de ADN correspondientes a la CP del virus (Figura 8), indicando una prevalencia general del 49,55%. En las localizaciones donde se analizaron plantas asintomáticas no se detectó la presencia del PRSV (Anexo 5). Los municipios en los cuales se identificó la enfermedad representan, en su mayoría, las principales zonas productoras de papaya de Cuba.
Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa al 1% de fragmentos del gen que codifica para la proteína de la cápsida del Virus de la mancha anular de la papaya obtenidos por RT-PCR a partir de ARN de hojas de plantas de papaya var. Maradol roja colectadas en Cuba. M: marcador de peso molecular (1 kb DNA ladder, Gibco BRL®), carriles 1-26, 28-56: plantas sintomáticas; 27 y 57: plantas asintomáticas.
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Los valores de I e IE oscilaron entre 0-100%, según la localidad y fecha de muestreo. Los valores de I e IE máximos (100%) se determinaron en Pinar del Río (San Luis), Artemisa (San Antonio de los Baños), Villa Clara (Santo Domingo), Sancti Spíritus (Sancti Spíritus) y Las Tunas (Las Tunas). En Mayabeque (Melena del Sur, Nueva Paz), Villa Clara (Corralillo), Sancti Spíritus (Trinidad), Holguín (Rafael Freyre) y Granma (Bayamo) los valores de I e IE fueron inferiores al 60%. En las plantaciones de papaya de Cienfuegos, Ciego de Ávila, Santiago de Cuba y Guantánamo no se identificó la enfermedad en las evaluaciones realizadas, aunque en Cienfuegos y Santiago de Cuba (Palma Soriano) se detectó la presencia de este virus en plantas ubicadas en jardines (Tabla 3).
La elevada incidencia y amplia distribución del PRSV en Cuba es la consecuencia de la alta presión de inóculo y abundancia de áfidos vectores de este virus en la mayoría de las zonas productoras de papaya. Según Roig (1965), Pinar del Río fue una de las provincias de Cuba donde se fomentaron las primeras plantaciones de papaya durante la década de 1930. Esta provincia es productora por excelencia de tabaco (Nicotiana tabacum L.), que es un hospedante de áfidos vectores del PRSV. Hernández y Gómez (2006) observaron que M. nicotianae es una especie de áfido adaptada a las zonas tropicales, y con capacidad de transmitir de forma eficiente el PRSV. La presencia de este áfido en el tabaco podría contribuir a la dispersión de la enfermedad en el campo, lo cual pudiera explicar las observaciones realizadas en San Luis.
No se detectó la enfermedad en algunas plantaciones de papaya en la provincia de Pinar del Río, ubicadas en los municipios San Luis, Consolación del Sur y Los Palacios (Anexo 5). En San Luis se observaron valores de I e IE del 100% en una plantación con más de 300 días de trasplantada, mientras que no se detectó el virus en plantaciones colindantes. Esto podría deberse a que las plantaciones en las que no se detectó la enfermedad eran jóvenes y solamente habían transcurrido aproximadamente seis meses del paso de los Huracanes Gustav (agosto de 2008) e Ike (septiembre de 2008) por esta provincia. Según las interacciones descritas para enfermedades virales (Hull, 2002), la relación planta-virus- vector es influenciada fuertemente por factores climáticos. Este fenómeno meteorológico trajo consigo fuertes vientos e intensas lluvias y pudo limitar la dispersión de la enfermedad en el campo por su influencia negativa en las poblaciones de áfidos vectores.
Tabla 3. Incidencia y severidad del Virus de la mancha anular de la papaya en plantaciones de papaya var Maradol roja en zonas productoras de Cuba.
Provincias Municipios Localidades Fecha Plantas I (%) IE (%)
Pinar del Río San Juan y Martínez El Cafetal* Feb. 2009 1/1 - - San Luis San Luis Feb. 2009 150/150 100 100 Artemisa San Antonio de
los Baños Finca El Recodo Ene. 2012 166/166 100 100 La Habana Boyeros Wajay Feb. 2011 82/100 82 74 Mayabeque Bejucal Arsenal* Sept. 2010 1/1 - -
San José de las Lajas Finca Las Papas Sept. 2010 128/200 64,18 64 Melena del Sur Los Pinos Abr. 2009 10/60 16,70 14,7
Ene. 2012 48/166 28,92 26,75 Güines Güines* Feb. 2009 1/1 - - Nueva Paz Nueva Paz Feb. 2009 10/60 16,70 12,70 Matanzas Jagüey Grande Jagüey Grande Mar. 2009 34/60 56,70 56,70
May 2013 100/100 100 94 Cienfuegos Cienfuegos Paraíso* May 2010 1/1 - - Villa Clara Corralillo Motembo Dic. 2012 65/222 29,28 29,19
106/222 47,75 47,75 Santo Domingo Santo Domingo Nov. 2008 333/333 100 98
Ene. 2010 250/250 100 100 Abr. 2010 150/250 100 88,50 Ene. 2011 166/166 100 93,40 Nov. 2011 174/222 78,38 53,55 Cifuentes Braulio Coroneaux Feb. 2012 63/100 63 34,60 Santa Clara Valle del Yabú Oct. 2008 191/200 95,50 95,50 Ago. 2012 9/115 7,83 6,09 Maleza Ago. 2011 35/333 10,50 5,90 Base Aérea Mar. 2012 2/80 2,50 1,50 2/115 1,74 1,04 El Gigante May 2010 123/200 61,50 61,10 Finca El Progreso Mar. 2013 36/80 45 34 Camajuaní Vueltas Feb. 2011 216/222 97,30 94,40 Placetas Placetas* Nov. 2010 1/1 - - I: incidencia; IE: índice de la enfermedad; *: plantas inspeccionadas en jardines; plantas sintomáticas/plantas evaluadas; -: valores de I e IE no calculados
Tabla 3. Incidencia y severidad del Virus de la mancha anular de la papaya en plantaciones de papaya var Maradol roja en zonas productoras de Cuba. (continuación)
Provincias Municipios Localidades Fecha Plantas I (%) IE (%)
Sancti Spíritus Sancti Spíritus La Bija Feb. 2010 10/60 16,7 12,0 Finca Las Delicias Feb. 2012 166/166 100 100
66/66 100 100 66/66 100 100 Trinidad Banao
Toma de agua Nov. 2012 19/222 8,56 6,40 56/240 23,33 21,17 Taguasco Taguasco* Feb. 2013 1/1 - - Camagüey Guáimaro Casa Azul Feb. 2012 161/166 96,99 94,46
14/88 15,91 8,41 Las Tunas Las Tunas Becerra Jun. 2011 6/65 9,23 7,38 100/100 100 100 192/200 96,00 94,80 Puerto Padre Parada Jun. 2011 21/128 16,41 10,16 Maniabón Jun. 2011 30/45 66,67 53,78 101/148 68,24 59,32 Holguín Calixto García Buenaventura* Feb. 2010 1/1 - -
Rafael Freyre La Caridad Dic. 2010 59/320 18,40 17,25 Oct. 2011 19/200 9,50 6,10 Granma Niquero Niquero* Nov. 2012 1/1 - -
Campechuela Campechuela* Nov. 2012 1/1 - - Manzanillo Manzanillo* Nov. 2012 27/30 90,00 90,00 Bayamo Huerto
Las Bayamesas Mar. 2012 43/185 23,24 19,46 13/222 5,86 5,23 23/160 14,38 12,63 Santiago de
Cuba Palma Soriano Palma Soriano* Nov. 2011 1/1 - - I: incidencia; IE: índice de la enfermedad; *: plantas inspeccionadas en jardines; plantas sintomáticas/plantas evaluadas; -: valores de I e IE no calculados
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Los elevados valores de incidencia del PRSV determinados en plantaciones de la Empresa de Cítricos de Jagüey Grande (Matanzas) pueden estar relacionados con la presencia de cítricos que actúan como hospedantes de áfidos vectores de este virus. En este sentido, González y Rodríguez (2008) informaron la presencia de los áfidos A. gossypii, A. citricola
y Toxoptera sp. en estas áreas. Entre estas especies, A. gossypii y A. citricola fueron informadas en Cuba como vectores eficientes del PRSV (Hernández et al., 1993; Hernández y Rodríguez 1988).
En Villa Clara, la presencia de hospedantes de insectos vectores del PRSV en las zonas evaluadas y las plantaciones de papaya infectadas en zonas aledañas, favorecen la dispersión del virus y coincide con lo señalado por Hernández y Rodríguez (1988). En Motembo (Villa Clara) se plantan aproximadamente 150 ha para la producción anual de papaya, donde se destinan las mismas áreas para su cultivo. Los valores de incidencia del PRSV determinados en estas plantaciones fueron elevados. Desde el informe del PRSV en estas áreas (Hernández y Rodríguez 1990), no se ha logrado reducir su incidencia, lo cual pudiera estar asociado a que las prácticas de manejo aplicadas no se han orientado en este sentido.
La colindancia con plantaciones infectadas puede contribuir a la dispersión mediante áfidos de este virus en nuevas áreas y requiere de medidas para su manejo. En Santo Domingo, se realizaron los experimentos para la obtención de la variedad Maradol roja, donde se produce su semilla básica y anualmente se destinan las mismas áreas para su cultivo. Esto último podría ser el motivo de la elevada incidencia e índice de la enfermedad en las evaluaciones realizadas en esta zona. Peña et al. (2010) informaron alta incidencia del PRSV en Cuba, aunque no determinaron el índice de la enfermedad en las plantaciones inspeccionadas ni realizaron su confirmación molecular.
En las provincias del este de Cuba son menores las áreas para la plantación de papaya, debido al relieve montañoso predominante en esta región. En Niquero, Campechuela y Manzanillo (Granma) se detectaron plantas de papaya infectadas con el PRSV en la cercanía de mercados agropecuarios. Estos puntos de venta, donde se comercializan frutas de papaya, se encuentran alejados a varios kilómetros de distancia de zonas de producción. En este sentido, Lecoq et al. (2003) demostraron el potencial de frutos de cucurbitáceas como fuente de dispersión de potyvirus a largas distancias. La presencia de frutos verdes
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infectados en los mercados podría servir de inóculo para la transmisión del PRSV mediante áfidos vectores y su posterior dispersión a las plantas de papaya cultivadas en los jardines de estas localidades. Por otra parte, las cucurbitáceas pueden constituir una fuente de dispersión de potyvirus y se informaron como hospedantes potenciales del PRSV-P (Mansilla et al., 2012), aunque esta situación no se ha detectado aún en Cuba.
En el caso del PRSV, según los períodos máximos de retención de las principales especies de áfidos que transmiten el virus (Kalleshwaraswamy y Krishna-Kumar 2008), las partículas virales en el estilete solo perduran unos minutos. Si se considera a M. persicae, como la especie más eficiente en la transmisión del PRSV, su naturaleza polífaga favorece la pérdida del virus durante las pruebas en el proceso de selección de hospedantes. Debido a lo mencionado anteriormente, no sería posible explicar la primera introducción del PRSV mediante insectos vectores en estas zonas urbanas (Niquero, Campechuela y Manzanillo), dado que debería existir una fuente de inóculo cercana. No obstante, en la actualidad las plantas de papaya infectadas con el PRSV detectadas en estas zonas, constituyen el inóculo para su dispersión.
En esta investigación el PRSV se identificó, mediante métodos de detección molecular, en las provincias de La Habana, Mayabeque, Matanzas, Villa Clara, Las Tunas, Holguín y Granma, coincidiendo con lo informado por Portal et al. (2006), Arocha et al. (2009) y Rodríguez et al. (2014). Además, este virus se identificó en Pinar del Río, Cienfuegos, Sancti Spíritus, Camagüey y Santiago de Cuba. Estos resultados demuestran que el PRSV se encuentra distribuido en las principales zonas productoras de papaya var. Maradol roja en Cuba.
Las evaluaciones sucesivas en las mismas localidades permitieron identificar sitios de reciente introducción del virus, como en el caso de Rafael Freyre. Aunque en el oeste y centro del país se destinan mayores áreas para el cultivo de la papaya, los valores de prevalencia observados en cada región son similares y reflejan la necesidad de aplicar tácticas eficientes en el manejo del PRSV. Dentro de estas tácticas se deben considerar la protección de viveros, la rotación de cultivos, el uso de barreras, el manejo de plantas hospedantes y la señalización de vectores para mitigar la elevada incidencia de este virus en las principales zonas productoras de papaya en Cuba.
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4.2 Agresividad de aislados cubanos del PRSV en plantas de papaya var. Maradol roja en condiciones de casas verdes
4.2.1 Descripción de los síntomas inducidos por el PRSV en plantas de papaya
Los síntomas inducidos por el PRSV en las plantas de papaya inoculadas con el aislado de Santo Domingo (control) iniciaron a partir de los 14 dpi. El 87% de las plantas mostraron aclarado de las nervaduras (Figura 9a) y el 13% restante manifestaron, como primer síntoma, un mosaico ligero caracterizado por pequeñas zonas claras distribuidas en la superficie adaxial de la hoja (Figura 9b). Este síntoma se manifestó de forma secundaria en las plantas que iniciaron con el aclarado de las nervaduras. Posteriormente, se observó un mosaico en forma de parches verde intenso alternados en la superficie adaxial de la hoja (Figura 9c). Seguido a esta sintomatología, en el 93% de las plantas evaluadas se observaron zonas abultadas de color verde intenso (Figura 9d). Las hojas jóvenes comenzaron a emerger deformadas en el 98% de las plantas inoculadas (Figura 9e). Solo el 2% de las plantas pasaron directamente de la formación de zonas abultadas a la reducción del mesófilo de las hojas hasta la filiformidad (Figura 9f), lo que se consideró como el estado más avanzado en la enfermedad.
Figura 9. Síntomas inducidos por el aislado de Santo Domingo del Virus de la mancha anular de la papaya en plantas de papaya var. Maradol roja inoculadas mecánicamente en condiciones de casas verdes. a: aclarado de las nervaduras; b: mosaico ligero; c: parches formados por zonas verde intenso que alternan en la hoja; d: zonas abultadas, de color verde intenso; e: deformación de la lámina foliar y f: filiformidad.
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Según la evolución de los síntomas inducidos por el aislado del PRSV de Santo Domingo en papaya var. Maradol roja en casas verdes, se elaboró una escala evaluativa, de 0-6 grados (Tabla 4). Esta escala se empleó para evaluar la agresividad de los síntomas inducidos por aislados del PRSV colectados en las principales zonas productoras de papaya en Cuba.
Los síntomas inducidos por el PRSV en condiciones de campo y de casas verdes son similares, pero en casas verdes se mantienen condiciones óptimas de temperatura, lo que favorece el desarrollo de los síntomas (Purcifull et al., 1984). Además, en estas condiciones se observó una mejor diferenciación de los síntomas según su evolución, lo cual requiere de una escala específica para condiciones de casas verdes.
Tabla 4. Escala evaluativa basada en el progreso de los síntomas inducidos por el Virus de la mancha anular de la papaya en plantas de papaya var. Maradol roja inoculadas mecánicamente en condiciones de casas verdes.
Grados Descripción de los síntomas
0 Planta sin síntoma visible. 1 Aclarado de las nervaduras.
2 Zonas claras distribuidas de forma uniforme en la zona adaxial de la hoja (mosaico ligero).
3 Parches verde intenso que alternan en la superficie adaxial de la hoja.
4 Zonas abultadas hacia la superficie adaxial de la hoja, de color verde intenso.