Componentes
Members
Del Real Soldevilla, Gustavo Investigador OPIs
Martín del Burgo, Mª Ángeles Tit. Sup. Act.Téc. Prof.
Escrig Llavata, Carmen Becaria
D e p a r t a m e n t o d e B i o t e c n o l o g í a
virales. Nuestro grupo, en colaboración con el Instituto de Ciencia de Materiales de Madrid, ha demostrado que bio-nanocomposites basados en el silicato natural sepiolita modificado con el polisacárido xantano sirven de soporte de par- tículas de virus influenza produciendo disper- siones acuosas estables adecuadas para administrarse como vacunas intramusculares e intranasales. Con estos compuestos, se han rea- lizado experimentos de vacunación en ratón observándose la producción de anticuerpos específicos y la protección frente a la infección gripal. También estamos iniciando el desarrollo de biosensores basados en transductores minia- turizados (ópticos y eléctricos) con polímeros de impresión molecular (MIP) y con técnicas de litografía blanda. Estos dispositivos, dirigidos al reconocimiento específico de virus influenza, se están desarrollando en colaboración con el Centro Nacional de Biotecnología, el Instituto de Ciencia de Materiales de Madrid y el Centro Nacional de Microelectrónica de Barcelona.
The pathogenic outcome of flu is quite variable depending on the viruses causing the infection and on other host-specific determinants. Our group is studying some of those factors using several field viral strains of porcine influenza showing high genetic, antigenic and clinical heterogeneity. One of them is the apoptosis-inducing PB1-F2 protein in infected cells which shows different truncated and
mutated forms depending on the viral strain. From the point of view of the host, we are studying the effect of gene Mx1 that plays an important role in innate immune response against the virus. Mx1 polymorphisms, with different antiviral activities, have been identified in pigs providing a potential method of selection of individuals harbouring favourable alleles.
Bio-nanocomposites are hybrid materials resulting from the assembly of inorganic nanosized solids with biopolymers, which can provide the biocom- patibility required to merge minerals and biological entities such as viral particles. Our group, in collab- oration with the Instituto de Ciencia de Materiales of Madrid, have shown that bio-nanocomposites based on sepiolite associated to the anionic poly- saccharide xanthan gum are able to bind to influenza virus particles giving very stable water dis- persions suitable as intranasal or intramuscular flu vaccines. Experiments carried out in mice demon- strate that the virus/bio-nanocomposites induce the formation of specific antibodies and the subse- quent protection against influenza. We have also envisaged the use of bio-nanocomposites as biosensors based on miniaturized transducers (optical and electronic), molecular imprinting poly- mers (MIP) and soft lithography techniques. This multidisciplinary project is being carried out in col- laboration with Centro Nacional de Biotecnología, Instituto de Ciencia de Materiales of Madrid and Centro Nacional de Microelectrónica of Barcelona.
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Objetivos
Objectives
El grupo estudia las bases moleculares de la patogenia mediante proteómica, analizando los factores de la célula cruciales para la infección y los genes víricos con los que interaccionan. Las estrategias que utiliza el virus de la peste porci- na africana para su entrada y transporte en la célula infectada y el control de la supervivencia celular han permitido plantear nuevos abordajes preventivos y terapéuticos aplicables a diversas infecciones víricas.
Palabras clave:
interacción virus-célula, apoptosis, entrada y transporte de virus.Our goal is the understanding of molecular basis of the pathogenesis, in other words, defining disease expression on the basis of its molecular elements.
We use proteomics to identify cell targets interact- ing with viral genes. African swine fever virus has developed strategies to manipulate cellular mecha- nisms for entry and transport and to control cell survival. This study has yielded new preventive and therapeutic approaches against a number of viral diseases.
Key words:
virus-cell interaction, apoptosis, viral entry and transport.Proyectos en convocatorias
competitivas
Competitive funding projects
WT 75813 (2005-2009). Development of African swine fever virus vaccines.
CSD2006-00007 MCYT (2007-2010). PORCIVIR. Patogenia de infecciones víricas del cerdo. EU-CT06-016236-FOOD (2007-2010) EPIZO- NE. Network of Excellence for Epizootic Disease Diagnosis and Control.
BIO2006-00651 MCYT (2005-2008). Identifi- cación de mecanismos moleculares de patogeni- cidad del virus de la peste porcina africana (VPPA) mediante el estudio de sus interacciones con dianas celulares.
PET2007-0785 MCYT (2008-2009). Desarrollo de moléculas antivirales basadas en la interac- ción de los virus con la dineína.
Actividades de I+D
R&D activities
Ya que numerosos virus codifican genes que manipulan las funciones celulares, sus genomas son depositarios de las señales críticas, los inhibi- dores y moduladores que controlan la organiza- ción y la supervivencia de la célula y la defensa
D e p a r t a m e n t o d e B i o t e c n o l o g í a
7. Interacción virus-hospedador / Virus-host interaction
Componentes
Members
Alonso Martí, Covadonga Investigador A2
Cabezas Ruiz, Marta Ayudante Invest.
Galindo Barreales, Inmaculada Tit. Sup. Act.Téc. Prof.
Hernáez de la Plaza, Bruno Tit. Sup. Act.Téc. Prof. Pablo Hernando, Eva Tit. Sup. Act.Téc. Prof. Cuesta Gueijo, Miguel Ángel Becario
D e p a r t a m e n t o d e B i o t e c n o l o g í a
inmunológica. Hemos estudiado el control de la supervivencia celular producido por el virus de la peste porcina africana y los mecanismos que uti- liza para su entrada y transporte en la célula. Hemos desarrollado herramientas frente a la infección basadas en la utilización del virus de las dianas celulares relevantes para dichos mecanis- mos. Para ello, hemos generado virus recombi- nantes que expresan la proteína verde y roja fluorescente para visualizar la dinámica de la infec- ción mediante videomicroscopía. Se analizó la fun- cionalidad de un regulador de la muerte celular programada, el homólogo a Bcl2 viral y sus proteí- nas de interacción celulares, que son proteínas que inducen apoptosis rápida, con el dominio BH3 solo: tBid, Bim e isoformas, Bik, Blk, Bad, Bmf, Puma y DP5, sin embargo no con otras como Noxa, más restrictivas como agonistas rápidos de la apoptosis. Demostramos que Bcl2 viral in vivo, es capaz de inhibir la apoptosis inducida por Bid, un actor central de la apoptosis mediada por los receptores de muerte (TNF, Fas), que es una inte- resante diana para drogas terapéuticas. También se han encontrado las dianas de interacción de proteínas víricas relacionadas con las primeras fases de la infección. Basándonos en estas dianas, comenzamos el desarrollo de sistemas de trans- porte o “delivery” de antígenos, genes y marcado- res de tipo diagnóstico, de múltiples aplicaciones biotecnológicas. Por ejemplo, se han desarrollado moléculas antivirales eficaces en inhibir la infec- ción in vitro. La diana de estos péptidos es la inte- racción del virus con la proteína motora microtubular dineína, crucial en la infección por diversos virus, cuyo uso potencial se extiende a enfermedades víricas humanas y animales.
As many viruses encode genes that induce, mimic or modulate cellular functions, their genomes may justifiably be viewed as major repositories of the critical signals, inhibitors and modulators that con- trol cellular organization and fate, and immune defense strategies. We have studied ASFV apopto- sis control and entry and transport mechanisms and we are developing tools against infection based in cellular targets relevant for those early mecha- nisms. We have generated recombinant African swine fever virus expressing green and red fluores- cent protein that made possible to visualize infec-
tion dynamics using time-lapse videomicroscopy. We further analyzed the functionality of a viral reg- ulator of programmed cell death, the viral Bcl2 homolog which has been found to interact with a number of cellular proapoptotic BH3 only proteins: tBid, Bim in its isoforms, Bik, Blk, Bad, Bmf, Puma and DP5 and not with others such Noxa, shown to be more restrictive as short term apoptosis ago- nists. Moreover, in vivo, this protein was found to interact with and block apoptosis induced by active Bid, a central actor involved in death receptor TNF- apoptosis pathway which is an interesting target of drug development. Then, we have focused our attention in cell targets relevant in early infection steps and we started the development of new sys- tems delivery of antigens, drugs, imaging agents and gene therapy.We developed antiviral molecules targeting the interaction of the virus with the micro- tubular motor dynein, which is crucial in the trans- port of many viruses, affecting both humans and animals.
Artículos científicos
Scientific papers
Galindo I, Hernáez B, Díaz-Gil G, Escribano JM, Alonso C (2008). “A179L, a viral Bcl-2 homolo- gue, targets the core Bcl-2 apoptotic machinery and its upstream BH3 activators with selective binding restrictions for Bid and Noxa”. Virology
375, 561-572.
Hernáez B, Escribano JM, Alonso C (2008). “The African swine fever virus protein p30 inter- acts with the heterogeneous ribonucleoprotein K (hnRNP-K) during infection”. FEBS Letters 582,
3275-3280.
Tesis doctorales
PhD theses
José Ignacio Quetglás. Bases moleculares de la patogenia en las fases precoces de la infección por el virus de la peste porcina africana. Director:
Covadonga Alonso Martí. Universidad Complu- tense de Madrid, Facultad de Ciencias Biológicas.
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D e p a r t a m e n t o d e B i o t e c n o l o g í a
Objetivos
Objectives
Los poxvirus son la base de vectores vacunales muy prometedores en el campo de la sanidad humana y veterinaria. La futura utilización de las vacunas recombinantes derivadas de estos vec- tores dependerá, en gran parte, de conseguir unas propiedades vacunales adecuadas, incluyen- do mayor inmunogenicidad y mejor seguridad. Nuestro grupo pretende mejorar los vectores vacunales a través de un conocimiento profun- do de la biogénesis y función de la envuelta del virus, que es crucial para determinar el compor- tamiento biológico del vector.
Palabras clave:
virus animales, poxvirus, vacunas recombinantes, envuelta viral.Poxviruses are the basis for promising vaccine vec- tors in the fields of human and animal health. Future use of poxvirus-derived recombinant vac- cines will largely depend on achieving adequate characteristics for the vaccines, including higher immunogenicity and better safety. The goal of our
group is to improve poxvirus vectors through a deeper understanding of the biogenesis and func- tion of the virus envelope, which is crucial to deter- mine the biological behaviour of the vector.
Key words:
animal viruses, poxviruses, recombinant vaccines, viral envelope.Proyectos en convocatorias
competitivas
Competitive funding projects
CPE03-021-C4 (2004-2008). El virus vaccinia como sistema de lanzadera de vectores basados en virus RNA.
BFU2005-05124 (2006-2008). Funciones de la proteína de la envuelta del virus vaccinia en la salida y entrada del virus.
S-0505/TIC/0191 (2006-2009). Microsistemas ópticos sensores (Microseres).
CT2006-037536 (2007-2009). Host immune activation optimised vaccinia virus vectors for vaccine development (MVACTOR).
Actividades de I+D
R&D activities
Entre las estrategias para aumentar la efectividad de las vacunas recombinantes, hemos utilizado la manipulación genética del virus vaccinia con el objetivo de hacer más inmunogénico al antígeno de interés. En particular hemos conseguido, por un lado, la expresión de antígenos mediada por replicones, y por otro el anclaje de antígenos en la partícula viral, para lograr una presentación más efectiva de los mismos.
La expresión mediada por un replicón se basa en insertar un cDNA del replicón derivado del virus Semliki Forest (SFV) bajo el control de la maquinaria de transcripción de vaccinia. Adicionalmente, si se combina el replicón con la expresión de las proteínas estructurales de SFV (insertadas en un locus diferente), se logra el
8. Poxvirus / Poxvirus group
Componentes
Members
Blasco Lozano, Rafael Investigador A2
Núñez del Castillo, Carolina Colaborador I+D+i
Lorenzo Gilsanz, María del Mar Tit. Sup. Act.Téc. Prof.
Sánchez Puig, Juana María Tit. Sup. Act.Téc. Prof. García Huerta, Paula Tit. Med. Act.Téc. Prof. Iniesta Vega, Miguel Tit. Med. Act.Téc. Prof.
D e p a r t a m e n t o d e B i o t e c n o l o g í a
empaquetamiento del replicón en partículas de ciclo único. Así, hemos logrado virus vaccinia recombinantes que, tras la infección, generan partículas de SFV que contienen el replicón y que, en una segunda ronda, producen la expre- sión del antígeno.
Un segundo objetivo ha sido la incorporación de antígenos en la partícula viral y su influencia en el tipo y magnitud de la respuesta inmune indu- cida por virus vaccinia recombinantes. Una colección de virus recombinantes que expresan la proteína verde fluorescente fusionada con proteínas de la superficie del virus intracelular (IMV) o extracelular (EEV) mostró que la posi- ción del antígeno es un factor importante en determinar el tipo (humoral o celular) y magni- tud de la respuesta inducida. Hemos aislado una serie de virus recombinantes similares a los anteriores utilizando la cepa MVA, para ampliar dichos estudios a una cepa no replicativa, y que puede utilizarse como vacuna.
Finalmente, hemos estudiado el papel de prote- ínas de la envuelta en la biogénesis y funcionali- dad de la envuelta viral. Virus con versiones modificadas de B5 permitieron mostrar que la interacción B5-A34 se establece a través de los dominios extracelulares de dichas proteínas, y que la presencia de A34 es necesaria para la incorporación de varias proteínas a la envuelta. Estudiamos la influencia de la palmitoilación en la función de B5, mediante mutagénesis de los resi- duos de cisteína a los que se une el palmitato. Sorprendentemente, la mutación de dichos resi- duos no afectó a la transmisibilidad del virus, ni a la incorporación de B5 a las envueltas virales, a pesar de que redujo las interacciones con otras proteínas de la envuelta.
Among the strategies to increase the effectiveness of recombinant vaccines, we have used the genetic manipulation of vaccinia virus with the aim of enhancing the immunogenicity of the antigen of interest. More precisely, we have achieved the expression of antigen mediated by replicons, and the anchoring of antigens in the viral particle to achieve a more effective presentation of them. Expression mediated by replicons is based on the insertion of the cDNA of a Semliki Forest virus (SFV)-derived replicon under the control of the tran-
scription machinery of vaccinia. Additionally, when combined with the expression of the structural pro- teins of SFV (inserted at a different locus), packag- ing of the replicon in single cycle particles was achieved. Thus, we isolated recombinant vaccinia viruses which, after infection, produce SFV particles containing the replicon that, in a second cycle, mediate expression of the antigen in different cells. A second goal was the incorporation of antigens into the viral particle and its influence on the type and magnitude of immune responses induced by recombinant vaccinia virus. A collection of recombi- nant viruses expressing green fluorescent protein fused to proteins from the membranes of the intra- cellular mature virus (IMV) or extracellular enveloped virus (EEV) showed that the position of the antigen is an important factor in determining the type (humoral or cellular) and magnitude of the response induced.We have isolated a series of sim- ilar recombinant viruses using vaccinia strain MVA, in order to extend these studies to a non-replicative strain that can be used as a vaccine.
Finally, we studied the role of envelope proteins involved in the biogenesis and function of the viral envelope. We have shown that A34-B5 interaction is established through the extracellular domains of these proteins, and that the presence of A34 is required for the incorporation of several proteins to the envelope. We have studied the influence of palmitoilation on B5 function through mutagenesis of cysteine residues modified by palmitate. Surprisingly, mutation of these residues did not affect virus transmissibility, nor the incorporation of B5 to enveloped virus, although it did reduce the interaction of B5 with other envelope proteins.
Artículos científicos
Scientific papers
Perdiguero B, Lorenzo MM, Blasco R (2008). “Vaccinia virus A34 glycoprotein determines the protein composition of the extracellular virus envelope”. Journal of Virology 82, 2150-2160.
Sánchez-Puig JM, Blasco R (2008). “AUG con- text and mRNA translation in Vaccinia virus”.
Spanish Journal of Agricultural Research 6 (Special issue), 73-80.
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Objetivos
Objectives
El principal objetivo del grupo es el desarrollo de vacunas recombinantes de subunidades mejora- das frente a patógenos animales de origen vírico. Este objetivo se aborda de dos maneras diferen- tes: a) reducción de costes productivos de las vacunas mediante su producción en sistemas no fermentativos basados en insectos como biofac- torías y b) desarrollo de moléculas adyuvantado- ras para mejorar la eficacia vacunal.
Palabras clave:
vacuna, recombinante, biofactoría, adyuvante.The main objective of the group is the development of improved subunit recombinant vaccines for ani- mal health focused on viral diseases. This objective is covered by two different ways: a) development of cost effective systems to produce the recombinant
vaccines based on the use of insects as biofactories and b) development of adjuvant molecules to increase vaccine potency.
Key words:
vaccine, recombinant, biofactory, adjuvant.Proyectos en convocatorias
competitivas
Competitive funding projects
CPE03-022-C5 (2004-2008). Desarrollos bio- tecnológicos para la utilización rentable de plan- tas como biofactorías.
WT 75813 (2005-2009). Development of African swine fever virus vaccines.
CSD2006-00007 (2007-2010). PORCIVIR. Patogenia de infecciones víricas del cerdo. UE CT06-016236-FOOD (2007-2010). EPIZO- NE. Network of Excellence for Epizootic Disease Diagnosis and Control.
AGL2007-66441-C03-03 (2007-2010). Desa- rrollo de herramientas para el control de la peste porcina africana.
Actividades de I+D
R&D activities
Los baculovirus son una herramienta central en la tecnología productiva de proteínas recombinan- tes. Por ello, durante el año 2008 se ha desarrolla- do investigación encaminada a la mejora de este vector de expresión, pensando tanto en el sistema de insectos como en el de fermentación con célu- las de insecto. De estos estudios se han podido desarrollar 3 vectores baculovirus diferentes denominados TopBac1, TopBac2 y TopBac3, que incorporan nuevos promotores derivados de virus e insectos. Estos nuevos vectores incrementan la productividad en un rango que va desde el 50% hasta el 200% y permiten la expresión temprana de proteínas en la célula, facilitando su procesa- miento y plegamiento. Los vectores han sido tam-
D e p a r t a m e n t o d e B i o t e c n o l o g í a
9. Vacunas / Vaccinology
Componentes
Members
Martínez Escribano, José Ángel Investigador A2
López Cabello, Eulalia Colaborador I+D+i Gómez Casado, Eduardo Ramón y Cajal
Martínez Pulgarín, Susana Tit. Sup. Act.Téc. Prof. Núñez Serrano, Carmen Tit. Sup. Act.Téc. Prof. Gómez Sebastián, Silvia Becaria
López Vidal, Javier Becario
D e p a r t a m e n t o d e B i o t e c n o l o g í a
bién mejorados con secuencias de direcciona- miento de las proteínas recombinantes a organe- las celulares específicas, mejorando procesamiento y eliminando degradación proteolítica.
En cuanto al desarrollo de vacunas, en el año 2008 cabe citar los estudios llevados a cabo sobre la proteína CAP del circovirus porcino tipo 2, la hemaglutinina del virus de la influenza y la proteí- na E2 del virus de la diarrea viral bovina. En los tres modelos se han realizado experimentos con éxito en animales de experimentación así como en los animales susceptibles. Para la mejora de la efectividad de estas vacunas, se han utilizado moléculas adyuvantadoras basadas en agonistas de antígenos TLR para favorecer una inmunidad innata (moléculas flagelina y BLS derivadas de bacterias) o basadas en el direccionamiento de los antígenos vacunales a células presentadoras de antígeno (molécula APCH I derivada de un anticuerpo en forma de cadena sencilla).
Por último se han completado los desarrollos diagnósticos para las enfermedades víricas Aujeszky, peste porcina africana y circovirus por- cino, desarrollando antígenos para serología y anticuerpos recombinantes para detección de virus en muestras biológicas.
Baculoviruses are a central tool in the productive recombinant protein technology. During 2008, the conventional baculovirus expression system has been improved by incorporating into the vector
Trichoplusia ni-derived vectors, giving a novel set of
baculovirus vectors denominated TopBac (1, 2 and