Las semillas de girasol fueron la primera fuente de lipasas estudiada en esta tesis y la metodología aplicada fue muy amplia debido al elevado número de variables que fueron modificadas continuamente con el objetivo de detectar actividad lipásica. La Tabla 4.1 presenta un resumen en donde se incluyen todas las experiencias junto con las variables que fueron modificadas de acuerdo a un orden cronológico. En todos los casos, la reacción elegida para la evaluación de la lipólisis enzimática fue la hidrólisis de aceite de girasol alto oleico, siendo ésta
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expresada como µmolAGL/gExtracto. La palabra “extracto” hace referencia al material utilizado como
biocatalizador, el cual puede presentarse en diversos formatos (pasta, líquido, polvo) dependiendo del procesamiento aplicado a las semillas.
En primer lugar se realizó un estudio exploratorio utilizando las semillas de girasol de la industria aceitera y de las diferentes fracciones luego del tamizado propuesto en la Sección 2.3.2.2 (R1-R3). Luego se evaluó la actividad de diferentes productos como lo son el polvo enzimático (R4) luego del desgrasado, la solución proteica (R6, R7) luego de la extracción con buffer, los sólidos residuales (R5) asociados a la misma y eventualmente el aceite obtenido luego del desgrasado (R21).
A partir de la Tabla 4.1 se puede observar que la metodología más aplicada para la evaluación de la acción lipásica fueron las técnicas de titulación (en continuo y a punto final, Sección 2.5.2) debido a su fácil y rápida aplicación. De todas formas, también se utilizaron técnicas cromatográficas (determinación simultánea de subproductos, Sección 2.5.3) para disponer de resultados más confiables.
El tiempo de reacción fue variable dependiendo de la experiencia y del método para evaluar la lipólisis enzimática; abarcó desde aproximadamente 15˗150 minutos hasta 24 horas. Se emplearon dos temperaturas de reacción (30 y 37 °C) y 4 medios de reacción diferentes (Novozymes, Santos˗60, Santos˗10 con buffer de fosfato y Sigma, Sección 2.4). En la Tabla 4.1 también se especifica el tipo de blanco de reacción empleado, siendo el mismo un factor importante discutido en profundidad dentro del presente capítulo. Por este motivo, y para facilitar la discusión de resultados, también se incorporó el resultado de la comparación entre las muestras y sus blancos de reacción correspondientes. En los casos en que fue posible, se realizó el análisis estadístico empleando la prueba t para la comparación de medias. El valor p obtenido fue incluido en la Tabla 4.1 permitiendo identificar fácilmente las diferencias significativas entre muestras y blancos de reacción (p< 0,05).
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Tabla 4.1 Tabla global de experiencias realizadas con extractos obtenidos a partir de semilla de girasol.
R Procesamiento de semillaa Desaceitadoa Semilla Método de
cuantificación* Medio reacción Extracto (g) gExtracto/ gMedio gAceite/ gMedio T (°C) Tiempo de
reacción Tipo de blanco AxB
Valor p M-B
R1 Molienda A, Tamizada
1000, Desaceitada Acetona-16h
Oleag. Moreno
2013 Continuo Novozymes 0,40 g 0,0067 0,0017 30 24 min Sin aceite 2x1 >0,88
R2 Molienda A, Tamizada
590, Desaceitada Acetona-16h
Oleag. Moreno
2013 Continuo Novozymes 0,40 g 0,0067 0,0017 30 23 min Sin aceite 2x1 >0,79
R3 Molienda A, Tamizada
ciego, Desaceitada Acetona-16h
Oleag. Moreno
2013 Continuo Novozymes 0,40 g 0,0067 0,0017 30 24 min Sin aceite 2x1 >0,42
R4 Molienda A, desaceitada Acetona-16h Oleag. Moreno
2013 Continuo Novozymes 0,40 g 0,0067 0,0017 30 20 min Sin aceite 2x1 >0,20
R5 Molienda A, desaceitada,
residuo sólido Acetona-16h
Oleag. Moreno
2013 Continuo Novozymes 0,80 g --- 0,0017 30 18 min Sin aceite 1x1 no
R6 Molienda A, desaceitada,
solución proteica Acetona-16h
Oleag. Moreno
2013 Continuo Novozymes 1,20 mL --- 0,0017 30 21 min Sin aceite 1x1 no
R7 Molienda A, desaceitada,
solución proteica Acetona-16h
Oleag. Moreno
2013 Continuo Novozymes 2,50 mL --- 0,0017 30 15 min Sin aceite 1x1 no
R8 Molienda A, desaceitada Hexano-
3x30min
Oleag. Moreno
2013 Continuo Novozymes 0,40 g 0,0058 0,0215 30 24 min sin aceite 1x1 no
R9 Molienda A, desaceitada Acetona-
3x30min
Oleag. Moreno
2013 Continuo Novozymes 0,40 g 0,0058 0,0167 30 24 min sin aceite 1x1 no
R10 Molienda A, desaceitada Acetona-16h Oleag. Moreno
2013 Continuo Santos-60 0,40 g 0,0067 0,0171 30 30 min Sin aceite 1x1 no
R11 Molienda A, desaceitada Acetona-16h Oleag. Moreno
2014 Continuo Santos-60 0,40 g 0,0067 0,0169 30 188 min Sin aceite 1x1 no
R12 Molienda A, desaceitada Acetona-16h Agronomía
PAN7076 Continuo Santos-60 0,40 g 0,0067 0,0171 30 142 min Sin aceite 1x1 no
R13 Molienda A, desaceitada Acetona-16h Oleag. Moreno
2013 Continuo Santos-60 0,40 g 0,0067 0,0168 37 163 min Sin aceite 1x1 no
R14 Germinado, molienda A,
desaceitada Acetona-16h
Oleag. Moreno
2013 Punto final Santos-10 0,10 g 0,01 0,117 37 48 h Sin aceite 1x3 <0,05
R15 Germinado, molienda A,
desaceitada Acetona-16h
Oleag. Moreno
2013 Punto final Santos-10 0,10 g 0,01 0,117 37 24 h Sin aceite 1x3 <0,05
R16 Germinado, molienda A,
desaceitada Acetona-16h
Oleag. Moreno
2013 Punto final Santos-10 0,10 g 0,01 0,117 37 24 h Sin aceite 1x3 <0,05
R17 Germinado, molienda A,
desaceitada Acetona-16h
Oleag. Moreno
2013 Punto final Santos-10 0,10 g 0,01 0,117 37 24 h Sin aceite 1x3 >0,18
R18 Germinado, molienda A,
desaceitada Acetona-16h
Agronomía
91 Tabla 4.1 Continuación.
Ra
Procesamiento de
semillab Desaceitadob Semilla
Método de cuantificaciónb Medio reacciónb,c Extracto (g) gExtracto/ gMedio gAceite/ gMedio T (°C) Tiempo de
reacción Tipo de blanco AxBd
Valor p M-Be R19 Germinado, molienda A,
desaceitada Acetona-16h
Oleag. Moreno
2014 Alto Oleico Punto final Santos-10 0,10 g 0,01 0,117 37 24 h Sin aceite 2x3 >0,14
R20 Germinación, molienda A Sin desaceitar Oleag. Moreno
2013 Punto final Santos-10 0,80 g 0,08 0,117 37 24 h Inactivación con T 3x3 <0,05
R21 Aceite de Germinación Acetona-16h Oleag. Moreno
2013 Punto final Santos-10 0,20 g 0,020 0,117 37 24 h Inactivación con T 1x3 >0,99
R22 Germinación, molienda A,
desaceitada Acetona-16h
Oleag. Moreno
2013 Punto final Santos-10 0,35 g 0,035 0,117 37 24 h Inactivación con T 1x3 <0,05
R23 Germinación, desaceitada Acetona-16h Agronomía
PAN7076 Punto final Santos-10 0,35 g 0,035 0,117 37 24 h Inactivación con T 1x3 <0,03
R24 Germinación, molienda A Sin desaceitar Oleaginosa
Moreno 2015 Punto final Santos-10 0,80 g 0,08 0,117 37 24 h Inactivación con T 1x3 >0,20
R25 Germinación, molienda A Sin desaceitar Oleag. Moreno
2013 CGL Santos-10 0,8 g 0,08 0,117 37 24 h Inactivación con T 1x2 <0,02
R26 Germinación, molienda A,
desaceitada Acetona-16h
Oleag. Moreno
2013 CGL Santos-10 0,35 g 0,035 0,117 37 24 h Inactivación con T 1x3 >0,90
R27 Germinación, molienda A Sin desaceitar Agronomía
PAN7076 CGL Sigma 0,35 g 0,0480 0,667 37 24 h Sin aceite 1x3 >0,22
R28 Germinación, molienda A,
desaceitada Acetona-16h
Agronomía
PAN7076 CGL Sigma 0,25 g 0,0333 0,667 37 24 h Sin aceite 1x3 >0,46
R29 Molienda A (sin germinar) Sin desaceitar Agronomía
PAN7076 CGL Sigma 0,40 g 0,0533 0,667 37 24 h Sin aceite 1x3 <0,01
R30 Molienda A, desaceitada Acetona-16h Agronomía
PAN7076 CGL Sigma 0,30 g 0,0400 0,667 37 24 h Sin aceite 1x3 <0,03
R31 Molienda B, desaceitada Acetona-16h Agronomía
PAN7076 CGL Sigma 0,30 g 0,0400 0,667 37 24 h Sin aceite 1x3 <0,03
a Número de referencia.
b Los métodos de procesamiento, medios de reacción y cuantificación se describen en las Secciones 2.3.2, 2.4 y 2.5.
c Para los medios Novozymes y Santos˗60 el pH se mantuvo en 7 sin uso de buffers (método en continuo). Para el medio Santos˗10 y Sigma se utilizó buffer de fosfato (100 mM, pH 7) y Tris˗HCl
(200 mM, pH 7,5), respectivamente.
d A representa el número de ensayos independientes y B representa el número de réplicas por ensayo.
e Valor p: Indica si la muestra dio mayor que el blanco de reacción (p crítico 0,05). En la mayoría de los casos se reporta el valor p de la comparación estadística (valores de p inferiores a 0,05 indica
diferencias significativas entre muestra y blanco); en aquellos casos donde el número de réplicas no era suficiente para realizar la comparación estadística se indican con “no” las muestras con valores numéricos menores o iguales al blanco y con “si” las muestras con valores mayores al blanco. Las líneas punteadas (−− − − − − −) indican un cambio importante en la metodología respecto a lo que se desarrolló en las filas anteriores.
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En la Tabla 4.1 también se especificó la semilla empleada y una breve descripción del procesamiento aplicado sobre la misma (germinada/sin germinar, desgrasada/sin desgrasar). También se indicó el método de desgrasado utilizado, siendo el método Acetona-16h el más frecuente (Sección 2.3.2.3), aunque en algunos casos también se analizó la semilla molida sin desgrasar (R20, R24, R25, R27 y R29).
En algunas muestras, el contenido de aceite y humedad se evaluaron mediante los métodos de las Secciones 2.2.2 y 2.2.3, respectivamente.