Si bien la estabilidad de este medio ya fue evaluada en la Sección 3.8.1 empleando técnicas cromatográficas, también fue necesario conocer su comportamiento al utilizar métodos de titulación.
3.8.5.1 Metodología
Se utilizó el medio Santos˗10 con buffer de fosfato (100 mM, pH 7) para preparar diferentes blancos de reacción. El término “blanco” fue utilizado para muestras que, si bien contienen todos los componentes que están presentes en las muestras de hidrólisis enzimática, los mismos se combinaron de forma tal de evitar que se desarrolle la reacción de hidrólisis entre el polvo de lipasa y el sustrato adicionado. En este caso se analizaron dos sistemas:
Blanco A: se colocaron 5 mL de buffer de fosfato (100 mM, pH 7) junto con 5 mL de emulsión en un frasco de vidrio. Se incubó a 37 °C bajo agitación magnética vigorosa durante 24 h. Luego se adicionaron 10 mL de etanol y se midió el pH (pHA).
Blanco B: se colocaron 5 mL de buffer de fosfato (100 mM, pH 7) junto con 5 mL de emulsión en un frasco de vidrio. Luego se adicionaron 10 mL de etanol (sin incubación) y se midió el pH (pHB).
3.8.5.2 Discusión de resultados
El pH resultó ser 8,13±0,01 para el blanco A y 8,10±0,02 para el blanco B. No se encontraron diferencias significativas (p>0,05) indicando que el medio mantiene su integridad a lo largo de las 24 horas de incubación. Esto fue positivo ya que permitió eliminar posibles sospechas de deterioro del sustrato ocasionadas por alguna interacción entre componentes bajo las condiciones evaluadas. Estos resultados fueron consistentes con aquellos obtenidos en la Sección 3.8.1.
Conclusiones
Como conclusión general se puede mencionar que la aceptabilidad de los resultados depende del medio de reacción elegido para la hidrólisis y de la metodología empleada en la cuantificación de AGL. En cuanto a la titulación con fenolftaleína, se encontraron ciertas inconsistencias al utilizar los medios Šinkūnienė y AOCS por lo que se decidió descartar ambas
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opciones. Por lo contrario, determinación resultó confiable cuando se trabajó con el medio Santos˗10, al menos para porcentajes bajos de AGL (aproximadamente 12 %).
Al utilizar la metodología de titulación en continuo con los medios Novozymes y Santos˗60 tampoco se encontraron evidencias para descartar estas metodologías como alternativas para determinar la acción lipásica, pero se debe tener en cuenta que esta técnica no permite procesar más de una muestra a la vez y no es adecuada para tiempos largos de reacción ya que se debe estar presente durante todo el proceso.
En cuanto al método de titulación a punto final, se determinó que el mismo también podría ser aplicado para cuantificar la acción lipásica utilizando el medio Santos˗10 y que permitiría detectar actividades realmente bajas (aproximadamente 1 % AGL m/m), permitiendo diferenciar muestras de blancos. También se obtuvieron resultados alentadores al aplicar esta técnica junto con el medio de reacción Sigma.
En cuanto a las curvas de titulación para el medio Santos˗10 obtenidas a partir de diferentes concentraciones de ácido oleico, las mismas se diferenciaron ampliamente entre ellas, indicando que este medio de reacción junto con el presente método, serían apropiados para la determinación de la acción lipásica.
Se evaluó también la eficiencia de recuperación de subproductos mediante los métodos A y B, permitiendo conocer el grado de error en las determinaciones de actividad empleando técnicas cromatográficas. En base a los resultados obtenidos, se decidió elegir el método B (éter etílico y hexano) ya que, además de alcanzar mejores resultados, también resultó más simple y fácil de aplicar. A continuación, se analizó la calidad de esta extracción para diferentes niveles de hidrólisis (2-90 %AGL). Se encontró una diferencia máxima de 3,3 %AGL entre el valor teórico y el obtenido luego de la extracción, considerándose aceptable para los objetivos de la presente tesis.
Finalmente, los estudios complementarios para evaluar las posibles modificaciones en el %AGL de los medios de reacción (Santos˗10 y Sigma) incubados bajo las condiciones deseadas sin utilizar lipasa, indicaron que no se encontraron diferencias entre los medios antes y después de 24 h de incubación (determinación mediante CGL), lo que indicaría la estabilidad del sustrato. Debido a que el medio Santos˗10 fue ampliamente utilizado a lo largo de la tesis, el mismo se estudió en mayor profundidad. En cuanto al tamaño de partícula de la emulsión, si bien se encontraron diferencias significativas entre el diámetro promedio antes y después de 2 h de agitación magnética vigorosa, dicha diferencia fue cualitativamente baja. Al analizar el tamaño de gota de los diferentes medios evaluados (Santos˗10 c/goma, Santos˗10 s/goma, medio 1:1 y medio 1:1 hidrolizado), se encontraron diferencias significativas para todos los casos: La
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presencia de goma disminuyó el diámetro promedio mientras que un incremento en la concentración de aceite (en ausencia de goma), generó un aumento del diámetro de gota. Además, la presencia de subproductos de hidrólisis como mono- y di-glicéridos, también contribuyeron a la reducción dicha variable, incrementando el área interfacial aceite-agua en ausencia de surfactante. En cuanto al efecto del etanol sobre el medio de reacción antes de la titulación, se encontró que el pH del medio antes de incorporar este solvente fue muy cercano a 7, lo que indicaría que el efecto buffer fue adecuado. Luego de agregar el etanol, se observó un incremento importante del pH (p<<0,01) el cual podría estar asociado a la ruptura del efecto del buffer, permitiendo así la correcta titulación de la muestra. Por último, se se verificó que el pH antes y después de la incubación del medio Santos˗10, durante 24 h a 37 °C y sin lipasa, se mantuvo estable.
Referencias
Balasaraswathi, R., & Sadasivam, S. (1997). Changes in oil, sugars and nitrogenous components during germination of sunflower seeds, Helianthus annuus. Plant Foods for Human Nutrition, 51(1): 71–77.
Horiba Scientific. (2010). Guidebook to Particle Size Analysis.
Sigma-Aldrich. (1999). Enzymatic assay of lipase, olive oil as substrate, Doc code VELIPA02 (método interno).
Las referencias empleadas para definir los diferentes métodos utilizados ya fueron consideradas en el Capítulo 2 “Materiales y métodos”.
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