Diversos autores reportaron actividad lipásica en semilla de girasol sin germinar (Mierzejewska et al. 2003; Sagiroglu et al. 2005; Avelar et al. 2013). Por este motivo las primeras experiencias se realizaron a partir de la semilla de girasol no germinada. En la Tabla 4.2 se
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muestran las primeras experiencias en las que se implementó el método de titulación en continuo para la determinación de la actividad lipásica. En las mismas se realizó un tamizado previo al desaceitado para evaluar si el tamaño de partícula influye en el desaceitado tal como lo mencionó Pierozan et al. (2009), en relación a la actividad de un biocatalizador obtenido a partir de trigo. El medio de reacción utilizado se eligió en base a las experiencias previas realizadas en las Sección 3.4.1, cuyos resultados indicaron que esta metodología podría ser aplicada a lipasas de origen vegetal.
Tabla 4.2 Experiencias pertinentes a las reacciones en las que se utilizó el método de titulación en continuo.
Ra Procesamiento
µmolNaOH Consumido
Valor pb Media Muestra Media Blanco R1 Tamizada 1000, desgrasada 32,9±3,8 33,7±5,3 0,8836 R2 Tamizada 590, desgrasada 36,2±6,3 38,1±6,4 0,7929 R3 Tamizada ciego, desgrasada 49,1±1,5 48,0±0,0 0,4226 R4 Desgrasada 47,5±9,7 35,4±0,7 0,2200
a Número de referencia de experiencias de Tabla 4.1. b Prueba t entre muestra y blanco.
Se reporta el consumo de NaOH a los 20 minutos de reacción utilizando 0,04 g extracto vegetal (catalizador), a 30 °C y pH 7 (buffer fosfato 100 mM).
Como puede observarse en la Tabla 4.2, si bien existió acidez titulable en todos los sistemas de reacción, en ninguna de ellas se pudo distinguir diferencias significativas cuando se las comparó con el blanco de reacción correspondiente (p>0,22). En la bibliografía se encuentran diversos trabajos en donde se estudia la actividad lipásica de diversos catalizadores de origen vegetal (ricino, canola, trigo) denominados comúnmente “polvos de acetona” y que reportan actividad lipásica utilizando métodos de titulación (Jachmanián et al. 1996; Cavalcanti et al. 2007; Pierozan et al. 2009). Estos resultados exigen una reflexión sobre la información disponible en algunas publicaciones (Jachmanián et al. 1996; Cavalcanti et al. 2007; Pierozan et al. 2009; Santos et al. 2013) ya que las mismas fueron el punto de partida para la elección de las condiciones experimentales planteadas en esta tesis. Sería posible que en dichos trabajos los blancos de reacción no hubieran sido llevados a cabo bajo las mismas condiciones de la reacción de interés, especialmente en lo referente al tiempo de contacto entre el polvo enzimático y el medio de reacción durante la incubación de la misma. En el blanco reportado por dichos autores el polvo se adicionó luego de incorporar el etanol (frenado de reacción), realizando la cuantificación de los AGL inmediatamente, sin considerar un tiempo de contacto representativo entre el polvo y el medio (como ocurre verdaderamente en la reacción). Esto es de gran importancia para detectar la actividad lipásica verdadera, ya que el medio de reacción puede haber extraído otros
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compuestos del preparado sólido que no hayan sido eliminados durante el desaceitado y que, a su vez, puedan dar falsas señales positivas en lo referente a la actividad lipásica. Es importante destacar que si el consumo de NaOH de las muestras de la Tabla 4.2 se contrastaran con un blanco que no incluye el polvo incubado junto con el medio (similar a los que realizan otros autores), los resultados indicarían la existencia de actividad lipásica llevando a resultados “falsos-positivos” (ya que el pH del medio de reacción sin polvo enzimático no se modificó a lo largo del tiempo, Sección 3.8.5).
En un trabajo previo (Sagiroglu et al. 2005) los autores estudiaron la purificación de la lipasa mediante sucesivas metodologías. Para ello, luego de obtener el polvo de acetona, realizaron una extracción colocando el polvo en buffer de fosfato (50 mM, pH 7) durante largos periodos de tiempo. El resultado final fue una solución con un contenido de proteína de 44 mgProteína/mL. Dicha solución presentó una actividad específica de 0,92 µmolAGL/min·mgProteína
en una reacción de 5 minutos, lo que equivale a una productividad específica de 817 µmolAGL/gPolvo
de acetona, aunque se debe recordar que la lipasa se encontraba parcialmente purificada. En base a
esto, la ausencia de actividad en las experiencias de la Tabla 4.2 podría explicarse debido a la falta de purificación de la fracción proteica, por lo que se prosiguió con las experiencias R4, R5, R6 y R7 (Tabla 4.1). Para realizar estos experimentos se produjo un nuevo lote de polvo que fue fraccionado. Una parte fue empleada en R4 mientras que el polvo restante fue sometido al proceso de extracción con buffer de fosfato (50 mM, pH 7 en presencia de CaCl2 0,5 mM)
(Sección 2.3.2.4, Sagiroglu et al 2005) para evaluar las diferentes fracciones obtenidas: los sólidos residuales depositados luego de la centrifugación (R5) y el líquido sobrenadante en diferentes concentraciones (R6 y R7). Si bien en R4 no se encontraron diferencias con el blanco (Tabla 4.2), tanto en muestra como en blanco se encontraron cambios de pH que conllevaron a la titulación de las muestras. En el caso de R5, R6 y R7, no se detectaron cambios de pH, por lo que la actividad también fue nula. Para verificar la extracción con buffer, las soluciones proteicas utilizadas en R6 y R7 fueron testeadas en su contenido de proteínas de acuerdo al método de la Sección 2.2.4 obteniendo un promedio de 71,79±3,18 mgProteina/mLSolución (promedio de dos experiencias
totalmente independientes). Esto verificó la existencia de proteínas pero, a pesar de esto, en las reacciones de hidrólisis no se identificó actividad catalítica en ninguna de ellas, bajo las condiciones estudiadas. Esto podría deberse a una extracción deficiente de las lipasas, o la inactivación total de las mismas durante el proceso.
Desde R8 a R13 se efectuaron diferentes cambios en la metodología para descartar otras posibles razones por las cuales no se pudo detectar actividad lipásica. En primer lugar, se cuestionó el método de extracción del aceite, por lo que se realizaron extracciones con
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hexano (R8) y acetona (R9) a tiempos más cortos, al mismo tiempo que se incrementó la concentración de aceite en el medio de reacción. Luego, se optó por modificar el medio de reacción (Santos-60, R10) e incrementar el tiempo de reacción (R11). Finalmente, se utilizó una semilla diferente (R12) y se aumentó la temperatura de 30 a 37 °C (R13).
Todos estos resultados evidencian la falta de actividad de la semilla en las condiciones estudiadas (medio de reacción, temperatura, métodos, etc.) o quizás un tiempo de reacción demasiado corto, ya que algunas enzimas requieren un tiempo de incubación determinado para adaptarse a las condiciones de reacción (Camacho Paez et al. 2002; Palla, 2012). En cuanto al método de cuantificación de la lipólisis enzimática, su eficacia para la determinación de la misma ya fue verificada en la Sección 3.4 por lo que no debería ser un punto crítico que impida su cálculo. Otras explicaciones podrían ser el deterioro de las semillas durante el almacenamiento o simplemente la ausencia de actividad de la misma independientemente de las condiciones de reacción empleadas.