3.8.3.1 Metodología general
La distribución de tamaño de las gotas se determinó utilizando un equipo de difracción de rayos láser Horiba LA - 950 V2 (Horiba Ltd., Kioto, Japón). El índice de refracción empleado fue de 1,3370 (medido con un refractómetro digital). El tamaño promedio de las gotas se expresó como el diámetro volumétrico medio. Este diámetro es conocido como D[4,3] y es calculado de forma automática por el software del equipo mediante la Ecuación 3.2 (Horiba Scientific, 2010),
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donde n representa el número de gotas de diferente diámetro, Di el diámetro geométrico y vi el
porcentaje volumétrico de cada una. En algunos casos también, se reportó el valor D[v, 0,90], como D90%, referido como el tamaño por debajo del cual se encuentra el 90 % de la población de
gotas. 𝐷[4,3] =∑ 𝐷𝑛1 𝑖4𝑣𝑖 ∑ 𝐷𝑖3𝑣 𝑖 𝑛 1 (Ec. 3.2)
El tamaño de gota se determinó en diferentes muestras: emulsión utilizada en medio Santos˗10 (buffer de acetato, 100 mM, pH 4,4, Sección 2.4.6), medio Santos˗10 con goma y sin goma, medio 1:1 (Sección 2.4.8) y medio 1:1 hidrolizado. Todas las experiencias se realizaron a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C). A continuación, se detalla el procedimiento utilizado para cada muestra.
La emulsión utilizada en el medio Santos˗10 se obtuvo utilizando 45 g de una solución de goma arábiga en agua al 3 % y 15 g de aceite. Se homogeneizó durante 10 minutos en un homogeneizador Pro Scientific (26000 rpm) e inmediatamente se midió por duplicado la distribución del tamaño de gota (EM0h). Luego se incubó la emulsión bajo agitación vigorosa a
temperatura ambiente durante 2 horas y se realizaron dos mediciones más (EM2h).
El medio Santos˗10 con goma se preparó de acuerdo a la Sección 2.4.6 (buffer de acetato, 100 mM, pH 4,4), mientras que el medio Santos˗10 sin goma se preparó de forma idéntica con la excepción de que la solución de goma arábiga en agua fue reemplazada por agua destilada pura para analizar el efecto de este componente sobre el tamaño de gota. Antes de la medición se tomaron 5 mL de ambas muestras y se las colocó a temperatura ambiente con agitación vigorosa durante 5 minutos. El medio 1:1 se preparó de acuerdo a la Sección 2.4.8 (2,5 mL de aceite alto oleico junto con 2,5 mL de buffer de acetato 100mM pH 4,4), mientras que en el medio 1:1 hidrolizado se reemplazó el aceite comercial por aceite parcialmente hidrolizado (APH1, Sección 3.7.1.2) para evaluar si los productos de reacción (AGL, MAG, DAG) influyen en el tamaño de gota.
3.8.3.2 Discusión de resultados
La Figura 3.7 muestra la distribución de tamaño de gota de la emulsión en función del diámetro de partícula para ambas muestras. Como se puede observar, se obtuvieron distribuciones bimodales con dos picos bien diferenciados. El primer pico se observó a
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aproximadamente 0,765 µm en ambas curvas, mientras que el segundo pico se identificó a los 10,404 µm y 9,496 µm para EM0h y EM2h, respectivamente.
Figura 3.7Distribución del tamaño de gota de la emulsión, para EM0h (sin incubar)
y EM2h (2h incubación). V (%): porcentaje volumétrico.
Los valores característicos del tamaño de partícula se muestran en la Tabla 3.8. Si bien el diámetro promedio de las partículas fue 26,689±0,600 µm y 30,025±0,785 µm para EM0h y EM2h,
respectivamente, se detectaron partículas con diámetros entre 0,766 y 200 µm para ambos casos. El valor D90% indica que el 90 % de las partículas posee un diámetro inferior a
46,517±2,346 µm y 54,582±1,603 µm para EM0h y EM2h, respectivamente.
Tabla 3.8 Diámetro medio de gota y D90% de la emulsión inmediatamente luego
de ser preparada (EM0h) y después de 2 h con agitación (EM2h).
EM0h EM2h valor p
Diámetro medio (µm) 26,689±0,600 30,025±0,785 0,0412 D90% (µm) 46,517±2,346 54,582±1,603 0,0568
Los valores se reportan como la media ± el desvío estándar. El valor p corresponde a la comparación de medias de las muestras EM0h y EM2h (n=3).
Para determinar si la diferencia encontrada entre los diámetros promedios de las muestras (p<0.05) tuvo algún efecto significativo sobre la actividad enzimática bajo las condiciones evaluadas, se requerirían mayores investigaciones. Si bien estas diferencias no son
0 2 4 6 8 10 12 0,4 4 40 400 V ( %) Diámetro (µm) Sin incubar 2 h incubación
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cualitativamente importantes, los resultados quedan a disposición para el posterior análisis de resultados en otras secciones de la tesis.
La Tabla 3.9 muestra el diámetro promedio para las muestras de medio Santos˗10 (con y sin goma) y el medio 1:1 y el medio 1:1 hidrolizado. Como se puede observar, al comparar el efecto de la goma arábiga, se comprobó que su presencia reduce en gran medida el diámetro medio de la gota, lo que implica un incremento en el área interfacial del medio de reacción.
Tabla 3.9 Diámetro promedio (µm) y relación aceite:agua (v/v) de las muestras analizadas: Medio Santos-10 s/goma, Medio Santos-10 c/goma, Medio 1:1 y Medio 1:1 hidrolizado.
Muestra Diámetro promedio (µm)
Relación aceite:agua (v/v) Medio Santos-10 s/goma 99,22±10,10 a 0,17:1 Medio Santos-10 c/goma 15,04±0,41 b 0,17:1 Medio 1:1 151,06±0,59 c 1:1
Medio 1:1 hidrolizado 49,60 ±0,43d 1:1
Letras diferentes en una misma columna indican diferencias significativas entre muestras (n=2, p<0,02).
Por otro lado, al comparar las muestras Santos˗10 s/goma con el medio 1:1, se pudo observar que la proporción de aceite también afectó significativamente el diámetro medio. Se identificó un incremento de aproximadamente el 50 % en el diámetro medio de gota al utilizar el Medio 1:1, el cual contaba con aproximadamente 6 veces el volumen de aceite contenido en el medio Santos˗10 s/goma. Estos resultados sugerirían una disminución considerable del área interfacial aceite-agua.
Por otro lado, el APH1 utilizado en el medio 1:1 hidrolizado contuvo 0,58±0,04 y 10,80±0,58 % (m/m) de MAG y DAG, respectivamente. Estos compuestos son conocidos por sus propiedades emulsificantes (Sección 1.2.1.9), por lo que su presencia podría explicar la reducción del tamaño de gota observado entre el medio 1:1 y 1:1 hidrolizado (p<0,01). Esta hipótesis sugeriría que a medida que avanza la hidrólisis, la mezcla de reacción podría incrementar el área interfacial debido a la formación de subproductos. Si bien el medio Santos˗10 c/goma presentó un diámetro medio menor que el 1:1 hidrolizado, la ausencia o adición de goma arábiga debe ser evaluada de acuerdo a las condiciones de reacción particulares de cada caso, considerando que la mera existencia de productos de reacción podría ser suficiente para prescindir de la misma.
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Por otro lado, en la Figura 3.8 se muestran las distribuciones de tamaño de gota para cada una de las muestras de la Tabla 3.9.
Figura 3.8 Distribución del diámetro promedio de gota de las diferentes muestras analizadas (cada una por duplicado): Medio Santos-10 s/goma, Medio Santos-10 c/goma, Medio 1:1 y Medio 1:1 hidrolizado. V (%): porcentaje volumétrico.
Como se observó en la Figura 3.8, la muestra Santos˗10 s/goma presentó una dispersión entre aproximadamente 10 y 400 µm mientras que al incorporar goma se obtuvo un rango entre 0,8-50 µm. La diferencia observada entre las curvas del duplicado se debe a que para preparar el medio se deben tomar 2,5 mL de una emulsión de agua y aceite creada empleando un
0 5 10 15 0 50 100 150 200 250 300 350 400 V %
Medio Santos-10 s/goma
0 5 10 0 10 20 30 40 50 60 V %
Medio Santos-10 c/goma
0 10 0 100 200 300 400 500 V % Medio 1:1 0 5 10 15 -5 15 35 55 75 95 115 135 155 175 V % Diámetro (µm) Medio 1:1 hidrolizado
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homogeneizador. Al no existir surfactante, la emulsión es muy inestable y por lo tanto más difícil de manipular. Por último, para las muestras del medio 1:1 sin hidrolizar e hidrolizado, los rangos fueron 11-151 y 0,9-152 µm, respectivamente.