Architecture and Design

de transferencia electrónica de PleosDyP4 (magenta) y de DyP2 (verde, código PDB: 4G2C) (Brown et al. 2012).

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CONCLUSIONES

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CONCLUSIONES

1) AauDyP1 es una peroxidasas de tipo DyP de clase V que presenta un canal de acceso para la entrada de sustratos poco voluminosos. Las estructuras de la enzima nativa y dos mutantes, resueltas por cristalografía de rayos X, nos han permitido identificar los residuos implicados en la formación del canal. Estos resultados han servido como punto de partida para optimizar la accesibilidad de sustratos al centro activo.

2) El canal de acceso presenta un estrechamiento, delimitado por un ácido aspártico (D168), una arginina (R332), una leucina (L357) y una fenilalanina (F359), que restringe la entrada al centro activo. De estos residuos, el ácido aspártico y la arginina son aminoácidos catalíticos que contribuyen a la desprotonación y posterior ruptura heterolítica del peróxido de hidrógeno, por lo que las mutaciones se diseñaron sobre la Leu357 y la Phe359 con el objetivo de mejorar el acceso al grupo hemo.

3) Las estructuras de los mutantes, L357G y F359G, conservan los motivos estructurales de la enzima nativa diferenciándose únicamente en la zona que da acceso al centro activo. En el mutante L357G se produce un ensanchamiento del diámetro del canal en la zona inmediatamente superior al átomo de hierro del grupo hemo, mientras que en el mutante F359G se observa un incremento de la cavidad del grupo hemo extendiéndose hacia uno de los grupos vinilo del mismo.

4) Los ensayos de actividad enzimática confirman que estas modificaciones mejoran el acceso al grupo hemo, facilitando el acceso de nuevos sustratos como los sulfuros con sustituyentes poco voluminosos. En ambos mutantes, se observó la oxidación del tioanisol (MPS) y del MTS, confirmándose una nueva actividad catalítica ausente en la enzima nativa. La reacción se produce de forma directa mediante el acceso del sustrato (MPS o MTS) al centro activo. Una vez posicionado, el átomo de azufre interacciona con el centro oxoferrilo (IV) produciéndose el sulfóxido correspondiente.

5) En la identificación de los productos de reacción se ha obtenido una sulfoxidación altamente selectiva de las reacciones catalizadas por el mutante F359G. En la oxidación de ambos sustratos se produce mayoritariamente el enantiómero S. Esta nueva actividad catalítica enantioselectiva podría tener aplicaciones en síntesis orgánica de alto valor añadido.

6) La resolución de la estructura cristalográfica de PleosDyP4 ha permitido caracterizar una nueva peroxidasa de tipo DyP fúngica y establecer las bases moleculares implicadas en la oxidación de manganeso. Su arquitectura es similar a las de otros representantes de este grupo, con dos dominios similares a α, β–ferredoxina dispuestos en una conformación de α, β–sándwich. Cada dominio presenta una lámina β central formada por cadenas antiparalelas y rodeadas por α–hélices. El cofactor hemo B se dispone en el núcleo de la proteína con las láminas β en su zona distal.

7) El centro activo está compuesto por la protoporfirina que interacciona con tres residuos muy conservados. En la zona proximal se sitúa una histidina coordinada al átomo de hierro. En la zona distal se disponen una arginina y un aspártico que intervienen en la desprotonación y posterior ruptura heterolítica del peróxido de hidrógeno, necesaria

CONCLUSIONES

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para la formación del compuesto I. Otro elemento conservado de este grupo, es el motivo GXXDG, posicionado en el entorno del grupo hemo interacciona con los propionatos. En

PleosDyP4 este motivo está compuesto por los residuos: G165–F166–L167–D168–

G169.

8) Los ensayos de difusión de manganeso en los cristales de PleosDyP4, permitieron identificar el sitio de unión a la enzima. El manganeso interacciona en la superficie de la proteína, dentro de una cavidad acídica formada por los residuos Asp215, Glu345, Asp352 y Asp354.

9) Estudios cinéticos y estructurales, junto con las simulaciones computacionales muestran que la oxidación del manganeso se realiza a través de una ruta de transferencia electrónica. El ion Mn2+ interacciona inicialmente con el Glu345 que cede un electrón a la Tyr338, siguiendo así la ruta de transferencia con la Thr338 y la His334, esta última coordinada con el átomo de hierro del grupo hemo.

10) Tanto las simulaciones computacionales como la resonancia paramagnética electrónica muestran la presencia de un triptófano superficial, el Trp405, que forma un radical triptofanilo en presencia de peróxido de hidrógeno. Este radical interacciona con la Thr338 de la cadena de transferencia electrónica catalizando la oxidación superficial de sustratos voluminosos.

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ABREVIATURAS

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ABREVIATURAS

AauDyP1 DyP1 de A. auricula–judae.

ABTS 2,2’–azino–bis (3–etilbenzotiazolin–6–sulfónico).

ADN Ácido desoxirribonucleico.

AutoMR “Automated Molecular Replacement”.

BRENDA “Braunschweig Enzyme Database” .

CC Coeficiente de Correlación de Pearson.

CCP4 “Collaborative Computational Project number 4”.

CcP Citocromo c peroxidasa.

CDE Superfamilia peroxidasa–clorito dismutasa.

CHMO Ciclohexanona monooxigenasa.

CIB Centro de Investigaciones Biológicas.

CiP “C. cinerea peroxidase”.

Clase I Clase intermedia.

Clase P Clase primitiva.

Clase V Clase avanzada.

Cld Clorito dismutasas.

COOT “Crystallographic Object–Oriented Toolkit”.

“Cryo cap” Base magnética.

CSIC Consejo Superior de Investigaciones Científicas.

CV Volúmenes de columna.

DMP 2,6–dimetoxifenol.

DO Densidad óptica.

DTT Ditiotreitol.

ABREVIATURAS

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EDTA Ácido etilendiaminotetraacético.

EPR “Electron paramagnetic resonance”.

ESRF “European Synchroton Radiation Facility” (Grenoble, Francia).

F Factor de estructura.

Fcal Fc Factor de estructura calculado.

Fobs Fo Factor de estructura observado.

GP “Generic peroxidase”

HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia o “High Performance

Liquid Chromatography”

HRP Peroxidasa de rábano o “Horseradish peroxidase”.

I Intensidad.

IPTG Isopropil–β–D–tiogalactopiranósido.