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La purificación y los ensayos cinéticos, tanto de las proteínas nativas como de sus mutantes abordados en este trabajo, se llevaron a cabo en colaboración con el grupo de Biotecnología para la Biomasa Lignocelulósica del Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), liderado por el profesor de investigación Ángel Tomás Martínez Ferrer. Las simulaciones computacionales se realizaron en colaboración con el departamento de modelado electrónico y atómico de proteínas del Centro Nacional de Supercomputación (BSC).

1.1. DISEÑO Y OBTENCIÓN DE MUTANTES:

Se diseñaron mutaciones puntuales en diferentes regiones de estas enzimas. En DyP1 de A. auricula–judae (AauDyP1) se obtuvieron dos mutantes en la región de acceso al grupo hemo, con el objetivo de esclarecer su potencial actividad en procesos de sulfoxidación asimétrica. Con este fin, se mutaron dos residuos en la entrada del canal, la leucina 357 por una glicina (L357G) y la fenilalanina 359 por otra glicina (F359G).

Para la enzima de P. ostreatus (PleosDyP4) se diseñaron mutantes para identificar el/los potencial/es sitios de unión y oxidación del Mn2+. Se diseñó una batería de mutantes simples: E190A, F194W, F194Y, D196A, D215V, Y339A, E345A, D352A, D354A y W405S. Además, se produjeron un doble mutante (D352A/ D354A) y un mutante triple (E345A/D352A/ D354A).

Para la obtención de los distintos mutantes se utilizó el método de mutagénesis dirigida (Kit de Stratagene’s QuikChange), empleando oligonucleótidos solapantes con la mutación de interés (Linde et al. 2016). El clonaje de los mutantes de DyP1 de A.

auricula–judae se realizó en el plásmido pET23a (Novagen), mientras que los mutantes de

DyP4 de P. ostreatus se clonaron en el plásmido pET15b, ambos presentan un gen de resistencia a ampicilina.

Tabla 1. Oligonucleótidos utilizados para la obtención de los distintos mutantes en las reacciones de PCR.

Enzima Mutante Secuencia

AauDyP1

L357G 5′– CT CAG GAG CGC GGC GGA GCG TTT GTG GCA

TAC–3′

F359G 5′– CT CAG GAG CGC GGC CTT GCG GGA GTG GCA

TAC–3′

PleosDyP4

**

E190A 5’– C GCC CAT GCA CAC TTC GGC TTC CTC GAC GGT

ATC TCC–3’

F194W 5’– C GCC CAT GAA CAC TTC GGC TGG CTC GAC

GGT ATC TCC–3’

F194Y 5’– C GCC CAT GAA CAC TTC GGC TAC CTC GAC

GGT ATC TCC–3’

D196A 5’– C GCC CAT GAA CAC TTC GGC TTC CTC GCC GGT

MATERIALES & MÉTODOS

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**Para la obtención del triple mutante E345A/D352A/D354A se utilizó el gen del doble mutante D352A/D354A, con los cebadores que se emplearon para el mutante E345A (Tabla 1).

Los plásmidos recombinantes se transformaron en células de E. coli DH5α, seleccionando las colonias transformadas en placas de Luria Bertani broth (LB)–agar suplementadas con 100 μg mL-1 _{de ampicilina. Se extrajo el ADN de los plásmidos} seleccionados, cuantificándose en un NanoDrop y, posteriormente, se secuenciaron para comprobar la presencia de la mutación deseada en los plásmidos recombinantes (Servicio de Secuenciación CIB; SECUGEN).

1.2. EXPRESIÓN:

Una vez obtenidos los clonajes en sus plásmidos correspondientes, se introdujeron en células de E. coli BL21 (DE3) pLysS, que presentan resistencia a cloranfenicol, para la posterior expresión de las enzimas recombinantes.

Para la expresión de las enzimas de A. auricula–judae se crecieron pre–cultivos en medio Luria Bertani (LB), suplementado con 100 μg mL-1 _{de ampicilina y 34 μg mL}-1 _de cloranfenicol, durante toda la noche a 37ºC con agitación. Estos cultivos se usaron para inocular 1 L de medio Terrific Broth (TB), con las mismas concentraciones de ampicilina y cloranfenicol, y se cultivaron a 37ºC y 200 rpm durante 3 h, hasta que alcanzaron aproximadamente una densidad óptica a 600 nm de 0.6 (DO600nm ∼0.6). En este punto, se indujo la expresión de las diferentes construcciones con la adición de isopropil–β–D– tiogalactopiranósido (IPTG) hasta una concentración final de 1 mM. La expresión del cultivo se dejó en las mismas condiciones durante 4 h más. Finalmente, las células se separaron mediante centrifugación.

En cuanto a la expresión de la enzima de P. ostreatus y sus mutantes, se crecieron las células transformadas en un medio autoinducibe ZYM–5052 (Studier 2005) durante 60 h a 16ºC, suplementado con 100μM de hemina, 100 μg mL-1 de ampicilina y 34 μg mL-1 de cloranfenicol, posteriormente los cultivos se centrifugaron.

Enzima Mutante Secuencia

PleosDyP4

**

D215V 5’– C CCG CTC CCA GGT CAA GTT CCG ATC AGA

CCG GGC–3’

Y339A 5’– GCT GCT CAC ATC AGA AAG ACC GCC CCG CGC

AAC GAT TTG GAG GGC CC–3’

E345A 5’– C CCG CGC AAC GAT TTG GCG GGC CCG CC–3’

D352A 5’– GGC CCG CCT TTG AAA GCT GCT ATT GAC AAC

CG–3’

D354A 5’– GG CCC GCC TTTG AAA GCT GAT ATT GCC AAC

CGT AGA ATC ATC CGC–3’

W405S 5’– C CAC TTC ATT CAG GAA TCT TGG GCC AAT GCC

C–3’ D352A/

D354A

5’– GGC CCG CCT TTG AAA GCT GCT ATT GCC AAC

MATERIALES & MÉTODOS

50

1.3. PURIFICACIÓN:

Las DyPs de A. auricula–judae, tras su expresión en E. coli, se acumularon en cuerpos de inclusión, se extrajeron mediante lisis celular por ultrasonidos (sonicación) en presencia de lisozima y a continuación se realizó el protocolo de solubilización y replegado descrito anteriormente por Linde y col. (Linde et al. 2014). Para ello, los cuerpos de inclusión se solubilizaron en una solución 50 mM Tris–HCl (pH 8.0), 8 M urea, 1 mM EDTA y 1 mM DTT, y se incubaron durante 1 h a 4ºC, centrifugándose para eliminar los restos celulares insolubles. Posteriormente, se hizo un plegamiento “in vitro” mediante diálisis frente a una solución 50 mM Tris–HCl (pH 6.0), 10 mM hemina y 0.2 M urea durante 6 días a 4ºC para obtener la holoenzima activa. Tras la diálisis se centrifugaron las muestras, para eliminar proteína no plegada y finalmente se concentraron.

La purificación de DyP1 nativa de A. auricula–judae y de sus mutantes, se realizó mediante cromatografía de intercambio iónico con una columna Resource Q (GE Healthcare). Las muestras se eluyeron en una solución 10 mM Tris–HCl (pH 7), con un gradiente de NaCl (0 – 0.3 M) y se recogieron aquellas fracciones que contenían DyP, identificadas por su absorbancia a 410 y 280 nm, para concentrarlas posteriormente. El correcto plegamiento de la enzima y sus mutantes se confirmó mediante el análisis de su espectro de absorbancia en 10 mM tartrato sódico (pH 5) y la concentración final se determinó utilizando el coeficiente de absorción molar

ɛ

Para las DyPs de P. ostreatus, las células decantadas tras la centrifugación, se resuspendieron en 100 mL de la solución de lisis (10 mM Tris–HCl pH 7.5, 10 mM imidazol y 300 mM NaCl), suplementada con 2 mg mL-1 _{de lisozima (Sigma–Aldrich) y} DNasa I (Roche Diagnostics, Manheim, Germany). Se sonicaron las muestras y posteriormente, se centrifugaron para separar los restos insolubles. Se concentró el sobrenadante por ultrafiltración (Amicon 10–kDa–cutoff; Millipore Pellicon).

La purificación se realizó en un equipo AKTA HPLC (GE Healthcare) con una columna HisTag (GE Healthcare) acoplada, a un flujo de 5 mL min-1. Las proteínas, que gracias a su expresión en el vector pET15b presentan una cola de histidinas en el extremo N–terminal, quedan retenidas por afinidad por el Ni2+ _{inmovilizado en la resina. Se realizó} un lavado con 3 volúmenes de columna (CV) (15 mL) del tampón de lisis (10 mM Tris– HCl pH 7.5, 10 mM imidazol, 300 mM NaCl), para eliminar las proteínas unidas inespecíficamente a la matriz y finalmente la elución de las DyP se realizó con un gradiente de 1 M imidazol (0 – 50%) en 5 CV. Las fracciones en las que eluyó la proteína se dializaron frente a 10 mM tartrato sódico (pH 5) y se concentraron (Fernández-Fueyo et al. 2018). Para comprobar la incorporación del grupo hemo se realizaron espectros UV– visible en los que se obtuvieron las bandas características de Soret a 406~407 nm y mediante el método piridin ferrihemicromo (Mendes et al. 2015). En ambos casos, se comprobó la pureza de las muestras mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS–PAGE).

RESOLUCIÓN ESTRUCTURAL POR CRISTALOGRAFÍA DE RAYOS–X: