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Longitud de enlace (Å) 0.01 0.01 0.01 Ángulos de enlace (º) 1.2 0.88 0.99 RAMACHANDRAN Favorable (%) 97.9 96.8 97.3 Permitido (%) 2.0 3.0 2.7 Valor atípico (%) 0.1 0.2 0

RESULTADOS

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Durante los ciclos de refinado y ajuste manual del modelo, se van revisando los valores de los parámetros Rwork y Rfree resultantes de cada sesión de refinado. Como se mencionó en Materiales y Métodos, estos parámetros indican el grado de acuerdo entre la densidad electrónica experimental y la calculada a partir del modelo. En la Tabla 7 observamos que todos los valores de Rwork son inferiores al 25%, obteniéndose un 19% y un 20% para la enzima nativa y el mutante L357G, respectivamente, mientras que el mutante F359G presenta un valor del 15%. Por otro lado, si comparamos estos valores con los obtenidos con el parámetro Rfree se alcanza una diferencia máxima del 5% en la estructura nativa, reduciéndose a un 4% para el mutante L357G y un 1% en F359G. El valor de estos indicadores y su poca variabilidad durante los últimos ciclos de refinado, nos llevaron a iniciar la validación de los modelos.

Inicialmente, se utilizaron las herramientas de validación del programa COOT (Emsley and Cowtan 2004) para obtener los diagramas de Ramachandran (Wlodawer 2017) y el análisis de rotámeros.

Como se mencionó en Materiales y Métodos, el diagrama de Ramachandran muestra el estado de los ángulos de enlace de la cadena peptídica. En la Figura 19 se recogen los gráficos de le enzima nativa y los mutantes de A. auricula–judae.

RESULTADOS

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Figura 19. Diagramas de Ramachandran de los modelos estructurales de AauDyP1. A)

AauDyP1 nativa, B) L357G, C) F359G. Se muestran en rosa las regiones más

favorables, en amarillo–anaranjado las regiones permitidas y en blanco las zonas no favorables.

En el diagrama de Ramachandran se considera que cada átomo presenta una dimensión similar a su radio de van der Waals. Así se delimitan las zonas donde los ángulos del enlace peptídico producen impedimentos estéricos (en blanco), las regiones naranjas abarcan disposiciones permitidas siendo más permisivos con la cercanía de los átomos y las zonas rosas corresponden a conformaciones sin impedimentos estéricos. Las glicinas se representan con triángulos ya que presentan menos restricciones en la disposición de los enlaces peptídicos, debido a la ausencia de cadena lateral.

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Como se muestra en la Figura 19, en la estructura nativa hay un porcentaje de residuos en las zonas favorables y permitidas del 99.7% mientras el mutante L357G presenta un 99.8% y en F359G el 100%. El bajo porcentaje de residuos en las regiones menos favorecidas indican la excelente calidad de los modelos estructurales.

Posteriormente, mediante POLYGON (Urzhumtseva et al. 2009) comprobamos la geometría de los modelos.La bondad de los modelos finales queda reflejada, además, por el ajuste de la estructura en los mapas de densidad electrónica. Como muestras representativas, en la Figura 20 se aprecia el ajuste de una sección de la cadena polipeptídica (Met331–Tyr337) de las estructuras de AauDyP1 y sus mutantes, a sus densidades electrónicas.

Figura 20. Mapas de densidad electrónica (2Fo-Fc) de la región comprendida entre

Met331 y Tyr337 para los modelos estructurales de A. auricula–judae. A)

AauDyP1 nativa en amarillo, B) L357G en magenta, C) F359G en azul.

1.4.2. DYP4 DE P. OSTREATUS:

La obtención de las fases de las estructuras de PleosDyP4 nativa y sus mutantes se realizó mediante reemplazo molecular. En la primera estructura resuelta, la del mutante F194Y se utilizó el modelo estructural de B. adusta (código PDB: 3AFV) (Yoshida et al. 2011) como modelo conocido y se empleó el programa MOLREP (Vagin et al. 2004) del paquete informático “Collaborative Computational Project number 4” (CCP4). Utilizamos como modelo de búsqueda la estructura de DyP de B. adusta ya que presenta mayor homología de secuencia (43.9%), que la de A. auricula–judae (40.2%), como se muestra en la Figura 21.

RESULTADOS

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Figura 21. Alineamiento de secuencias de DyP de P. ostreatus, B. adusta (código PDB:3AFV) y A. auricula–judae (código PDB:4W7J). En letra blanca sobre fondo

rojo destacan los residuos estrictamente conservados, mientras los residuos de características similares se muestran en negrita sobre fondo amarillo.

Tras construir y refinar la estructura del mutante F194Y, utilizamos las coordenadas finales para resolver mediante reemplazo molecular las estructuras de los demás mutantes y de la enzima nativa. Para ello, utilizamos de nuevo el programa MOLREP (Vagin et al. 2004) obteniéndose las funciones de rotación y translación que se detallan en la Tabla 8.

Tabla 8. Reemplazo molecular de PleosDyP4 y sus mutantes

Función de rotación Función de translación TFZ F194Y 91.25 164.12 163.45 -0.23 0.25 -0.14 24.57

RESULTADOS

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Una vez obtenidos los modelos iniciales se realizaron las primeras etapas de refinado y ajuste manual del modelo. Durante estas, hemos utilizado un ajuste de cuerpo rígido (“Rigid body”) y un refinamiento parcialmente restringido mediante el programa REFMAC (Vagin et al. 2004). Con los modelos sucesivos refinados, se calculan los mapas de densidad electrónica (2Fo - Fc y Fo - Fc) sobre los que ajustamos el modelo, modificando y construyendo las zonas que no se ajustan a la densidad electrónica. Para ello utilizamos el programa COOT (Emsley and Cowtan 2004). Este proceso es iterativo, con varios ciclos de refinado y ajuste, antes de alcanzar la concordancia adecuada entre densidad electrónica y modelo. En los últimos pasos se incorporan las moléculas de agua, que se disponen dentro de la densidad electrónica teniendo en cuenta las características de los aminoácidos de su entorno. En la Tabla 9 se muestran los parámetros finales obtenidos después del refinado de las estructuras de PleosDyP4 y sus mutantes.

Tabla 9. Estadísticas del refinado de PleosDyP4 y sus mutantes.

REFINADO Nativa Nativa–

Mn E190A F194W F194Y D196A

Resolución (Å) 88.3–1.6 88.3–1.2 69.7–2.4 88.4–2.5 70.2–1.6 60.3–2.3 Completitud (%) 99.7 98.9 99.9 99.5 97.1 97.9 Rwork 0.16 0.15 0.20 0.18 0.16 0.18 Rfree 0.20 0.17 0.26 0.24 0.20 0.22 ÁTOMOS NO HIDRÓGENOS Proteína 7506 3757 3768 7496 7484 7495 Grupo Hemo 84 43 43 86 86 86 Iones – 1 Mn 1 Na – – – 2 Na H2O 861 586 13 184 1119 563 DESVIACIÓN CUADRÁTICA MEDIA (RMS) Longitud de enlace (Å) 0.02 0.02 0.01 0.01 0.02 0.01 Ángulos de enlace (º) 1.9 1.9 1.6 1.6 2.0 1.4 RAMACHANDRAN Favorable (%) 97.0 96.7 95.3 98.0 97.8 97.1 Permitido (%) 2.7 2.9 4.3 1.9 2 2.6 Valor atípico (%) 0.3 0.4 0.4 0.1 0.2 0.3 Código PDB – – – 6FSL 6FSK –

En los mutantes de PleosDyP4 los valores de Rwork son inferiores al 25%, siendo el mutante E190A el que presenta un Rwork más elevado (20%), en F194W y D196A obtuvimos un 19% y finalmente la estructura nativa y el mutante F194Y presentaban el valor más bajo (16%). Comprobamos la diferencia entre Rwork y Rfree, siendo la más elevada la obtenida para los mutantes E190A y F194W con una diferencia del 6%,

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mientras en el resto de estructuras es del 4%, excepto en el complejo de la enzima nativa con Mn2+ _{que es del 2%.}

Las estructuras se validaron inicialmente mediante las herramientas del programa COOT (Emsley and Cowtan 2004). Realizamos análisis de rotámeros para comprobar la disposición de las cadenas laterales, ajustando las más alejadas de las restricciones estereoquímicas. Posteriormente, revisamos los diagramas de Ramachandran (Wlodawer 2017). En la Figura 22 y Figura 23 se muestran los diagramas obtenidos de las estructuras de PleosDyP4 y sus mutantes.

Figura 22.Ramachandran de las estructuras de PleosDyP4, el complejo con manganeso y los mutantes E190A y F194W. En rosa se muestran las regiones favorables, en

naranja las regiones permitidas y en blanco las regiones inusuales. Los residuos se representan como triángulos (Glicinas) o cuadrados de color azul en regiones favorables o aceptables, o rojo en regiones atípicas

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Figura 23. Ramachandran de las estructuras de PleosDyP4 y los mutantes F194Y y D196A. En rosa se muestran las regiones favorables, en naranja las regiones permitidas

y en blanco las regiones inusuales. Los residuos se representan como triángulos (Glicinas) o cuadrados de color azul en regiones favorables o aceptables, o rojo en regiones atípicas.

En los diagramas de Ramachandran comprobamos que todas las estructuras presentan un alto porcentaje de residuos situados en las zonas favorables y permitidas, del 99.6 o 99.7%.

Finalmente, utilizamos el programa POLYGON (Urzhumtseva et al. 2009) para comprobar la geometría de los modelos. La calidad de los modelos finales queda reflejada además por el ajuste de la estructura en los mapas de densidad electrónica. En la Figura 24 se muestra el ajuste de una parte de la cadena aminoacídica (Ile358 – Phe365) de los modelos estructurales obtenidos, a su correspondiente densidad electrónica (2Fo - Fc).

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Figura 24. Fragmentos de los mapas de densidad electrónica de PleosDyP4 y sus mutantes de una sección de la cadena polipeptídica (Ile358 – Phe365). La densidad

electrónica (2Fo − Fc) se representa mediante una red de color gris. A) PleosDyP4

nativa a una resolución de 1.6 Å. B) Complejo PleosDyP4-Mn a una resolución de 1.2 Å. C) E190A a 2.4 Å. D) F194W a 2.5 Å. E) F194Y a 1.6 Å. F) D196A a 2.3 Å de resolución.