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A.- Estudio de la situación frente a virus de la hepatitis. Para el virus de la hepatitis A (VHA) se determinó IgG-VHA y en casos seleccionados IgM-VHA. Para el VHB se determinaron antígeno de superficie (Ag-HBs) y anticuerpos frente al antígeno de superficie (Ac-antiHBs), anticuerpos anti-core IgG (Ac- Core-VHB), y en caso necesario se determinó además antígeno y anticuerpo e (Ag-HBe y Ac-antiHBe), e IgM anti-core (Anti-core-IgM). Para el virus de la hepatitis C (VHC)se determinaron anticuerpos (Anti-VHC).

La medición de antígenos/anticuerpos tanto de VHA como VHB y VHC se realizó por quimioluminiscencia (auto analizador ARQUITECT-Abbott). En el caso de hepatitis C, como confirmatorio se empleó un enzimoinmunoanálisis de tipo lineal (LIA), RIBA I y II, que incorpora antígenos del virus VHC derivados de la región del core y fijados a tiras de nylon (INNOGENETICS).

En caso de positividad de alguno de los antígenos de VHB o VHC, el diagnóstico se confirmó o descartó mediante detección de ADN-VHB (COBAS Taqman HBV, Roche) y ARN-VHC, respectivamente.

En las infecciones comprobadas por VHB o VHC, se determinó la carga viral de los mismos en copias/mL, expresada en números absolutos y en logaritmo de base 10. Asimismo en estos casos se determina el genotipo viral.

Otros virus de la hepatitis: virus de la hepatitis D y virus de la hepatitis E

(VHD, VHE) se determinaron sólo en casos seleccionados. Se realizó detección de antígeno y anticuerpos por enzimoinmunoanálisis frente al virus (Radim).

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B.- Estudio de sífilis: mediante determinación de test no treponémicos: prueba de reagina plasmática rápida (RPR) en todos los pacientes (Biokit); ésta consiste en suspensión de cardiolipina que contiene partículas de carbón, que al unirse a los anticuerpos del paciente, produce una floculación de color negro observable a simple vista. En aquellos niños con sospecha de sífilis y en los que la serología inicial fue positiva, se realizaron además test treponémicos (FTA), por técnica de inmunofluorescencia directa (BioMerieux).

C.- Estudio del virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH): detección inicial de anticuerpos mediante técnica de quimioluminiscencia (autoanalizador ARQUITECT-Abbott). En los casos con resultados positivos, se realizaron pruebas de confirmación con Western-blot (enzimoinmunoanálisis indirecto- Inmunoblot- sobre tiras de nitrocelulosa que contiene todas las proteínas constitutivas del virus VIH-1 o VIH-2) y Peptilav (Enzimo-inmunodot con péptidos sintéticos fijados en tiras que producen epítopos específicos de las proteínas transmembrana gp41 y gp36 de los virus VIH-1 y VIH-2 respectivamente) (Bio-Rad) para VIH en pacientes mayores de 18 meses. En los niños menores de 18 meses se realiza PCR-ARN-VIH (cuantificación de carga viral plasmáticas) y PCR-ADN-VIH intracelular, con repetición de al menos 2 PCR separadas en el tiempo para asegurar su negatividad o valorar el inicio terapéutico si fuese positiva cualquier PCR de VIH.

D.- Otros: se solicitó estudio de citomegalovirus (CMV), virus de Epstein- Barr (VEB) y de toxoplasmosis en casos seleccionados. En el primer caso se determinaron inicialmente anticuerpos IgG e IgM si lo precisara, así como PCR en orina y carga viral. En el caso de VEB se realizaron anticuerpos IgG e IGM,

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y anticuerpos heterófilos en caso de sospecha de infección aguda. Para el estudio de toxoplasmosis, se determinan de igual forma anticuerpos IgG e IgM.

Para la detección de anticuerpos en todos ellos se empleó el autoanalizador VIDAS (BioMerieux), con método inmunoenzimático tipo sándwich en dos etapas, asociado a detección final por inmunofluorescencia (ELFA), para detección de anticuerpos IgG e IgM.

E.- Estudio de tuberculosis: se realizó una primera prueba de tuberculina en la primera consulta, y en la mayoría de los casos otra evolutivamente, entre los 3-6 meses siguientes para obviar el periodo ventana. La técnica empleada fue la inyección de 2 UT de proteína tuberculínica purificada PPD RT 23. La lectura de la intradermorreacción de Mantoux fue realizada por un pediatra o Diplomado Universitario de Enfermería (DUE) experto, a las 48-72 horas mediante la medición en milímetros del diámetro mayor de induración perpendicular al eje mayor del brazo. La interpretación del Mantoux se efectuó de acuerdo con las normas vigentes establecidas por el documento de consenso de la Sociedad Española de Infectología Pediátrica (SEIP),(101) _{y se}

incluyó en un documento fichado y firmado en la historia del niño.

En casos seleccionados, especialmente en los que tenían documentación de vacuna BCG previa y escara en el deltoides y para descartar infección tuberculosa latente (ITBL) o enfermedad tuberculosa (ET) se realizó la prueba Inmunoenzimática de quantiferón (QF-TBgold®_{) mediante técnica de}

T-SPOT, basado en detección de células T efectoras con liberación de interferón gamma tras exposición a antígeno de Mycobacterium tuberculosis.(102)

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F.- Estudio de paludismo: se realizó gota gruesa y extensión fina de sangre periférica en todos los niños procedentes de área endémica de malaria. Se realizaron además, técnicas de detección rápida de antígeno de

Plasmodium falciparum y antígeno panmalárico (T1 y T2) mediante detección

de proteína rica en histidina, y aldolasa específica de Plasmodium respectivamente, por Inmunocromatografía (Binaxnow®_{), con 15 microlitros de}

sangre con EDTA. En los casos más recientes se empleó junto con el anterior, el test CarestartRapydtest®_{, con detección de proteína rica en histidina, y LDH}

en lugar de aldolasa. Para su realización se utilizan 5 microlitros de sangre con EDTA.

Los casos de paludismo fueron confirmados mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR-Plasmodium) cualitativa, para detección de especie y resistencia de la misma, siendo las muestras de sangre enviadas y procesadas en el centro de referencia: Departamento de Microbiología Instituto Carlos III de Madrid (Majadahonda, Madrid).

G.- Estudio de enfermedad de Chagas: detección mediante ELISA e Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) de anticuerpos frente a Trypanosoma cruzi en aquellos niños provenientes de área endémica de enfermedad de Chagas.

H.- Estudio de parásitos intestinales o sistémicos en muestras fecales: según protocolo-estudio estándar realizado en la Unidad de Microbiología- Parasitología del hospital Carlos III:

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- Todas las muestras fueron sometidas a técnica de concentración de Ridley. Desde Agosto del año 2003 hasta Agosto de 2008 el reactivo empleado fue SAF (Sodium Acetato Formalina) 3,5 mL y se disminuyó la cantidad de Acetato de Etilo a 1,25 mL. Desde esa fecha hasta la actualidad se emplean 3,3 mL de SAF y 20 microlitros de Tritón X, que es un surfactante, con filtros de 425 micrómetros. (Mini Parasep®_{SF; APACOR, UK).}

- A todas las muestras se le realizó tinción de Field, y de Ziehl-Nielsen modificada.

- Para la identificación de gusanos adultos se realizó fijación en formalina tamponada al 10%, calentada a 60-63º C y posterior visualización macro y microscópica.

- Para detección de oxiuros se realizó test de Graham, idealmente con 3 muestras obtenidas mediante papel adhesivo del margen anal de días consecutivos, y 3 muestras fecales de días no consecutivos. Ante sospecha de oxiuriasis se solicitó además muestras de heces por la posibilidad de infestación concomitante con otras parasitosis intestinales.

- Se realizó test rápido de detección de antígenos por Inmunocromatografía (ICT) de Giardia intestinalis y Cryptosporidium (Giardia/CryptosporidiumQuikChek® _{de Alere y StickCrypto-Giardia}® _de

Operon) en 3 muestras fecales de días alternos.

En casos seleccionados se realizó estudio para detección de parásitos fundamentalmente tisulares, mediante serología (Strongyloides stercoralis,

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(para microfilarias diurna y nocturna) o PCR cualitativa, enviándose las muestras al centro de referencia Departamento de Microbiología Instituto Carlos III de Madrid (Majadahonda, Madrid).

- Para el estudio posterior además se clasificaron según fueran patógenos obligados o no. Los parásitos no patógenos fueron los siguientes: género Entamoeba diferente a la Entamoeba histolytica (incluye Entamoeba

coli, Endolimax nana, Entamoeba hartmanii, Iodameba butschlii), género

Cryptosporidium, Blastocystis, Dientamoeba fragilis, Chilomastix mesnilii,

siempre que los pacientes estuvieran asintomáticos, y, si presentaban síntomas, que éstos no fueran atribuibles a la presencia de estos parásitos.