3.4.1. PREPARACIÓN DE EXTRACTOS ETANÓLICOS
El tejido fresco congelado (camote sin cáscara) se trituró en un minipimer Philips. Se realizaron ensayos preliminares donde se definieron los pesos a tomar, 2 g de tejido fresco y 4 g de tejido cocido en la variedad “Toquecita” y 0.5 g de tejido fresco y 1 g de tejido cocido en la variedad “Guayaco Morado”, se homogenizó con 10 mL de etanol al 96%. Se cerró y se protegió de luz, se llevó a agitación durante 30 minutos, luego se centrifugó
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a 6000 rpm (centrífuga Hermle Z323) por 15 minutos a 4ºC, después se filtró para recoger la fase líquida, se dispensó en viales de 1 mL con ayuda de una micropipeta y finalmente se llevó a congelación a -20ºC hasta su posterior análisis.
3.4.2. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE FENOLES TOTALES (FT)
Para la determinar el contenido de fenoles totales se empleó el reactivo Folin-Ciocalteu según el método descrito por Singleton & Rossi (1965). Se tomaron alícuotas de extracto etanólico de 70 µL y 40 µL para camote Toquecita en estado fresco y cocido respectivamente; y 60 y 30 µL para camote Guayaco Morado es estado fresco y cocido respectivamente, se transfirieron a un tubo de ensayo que contenía agua bidestilada en diferentes volúmenes para completar 1130 µL y 1160 µL en la variedad Toquecita 1140 µL y 1170 µL en la Guayaco Morado. Se añadió 100 µL de la solución Folin-Ciocalteu y agua destilada en una relación (1:1), se homogenizó y se mantuvo a temperatura ambiente por 3 minutos.
Transcurrido este tiempo se adicionó 200 µL de Na2CO3 20% p/v en NaOH
0.1 N. La mezcla se homogenizó, se cubrió con Parafilm®M y se protegió de la luz durante 60 minutos de tiempo de reacción, finalmente se realizó la lectura de la absorbancia a 760 nm en un espectrofotómetro Génesis 20- Thermo Spectronic. Cada extracto se analizó por triplicado.
La cuantificación de fenoles totales se realizó mediante una curva de calibración usando como solución patrón ácido gálico; los volúmenes
tomados de la solución patrón fueron de 20 µL a 45 µL (cada 5 μL). Los
32 3.4.3. ANTOCIANINAS TOTALES (AT)
La determinación de AT se realizó únicamente en el camote Guayaco Morado en fresco y cocido usando la metodología descrita por Beas et al. (2011). Bajo la protección de la luz se pesaron 0.75 g de tejido congelado y triturado, tanto de muestra fresca como de muestra cocida, y se añadió 10 mL de metanol-HCl 1% (regulador de pH), se llevó a agitación durante 10 minutos manteniendo bajas temperaturas y protegiendo de la luz para evitar el deterioro de las antocianinas, posteriormente se centrifugó a 6000 rpm durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante se filtró, refrigeró y almacenó en la oscuridad mientras que al pellet se añadió 10 mL más del solvente y se continuó con el proceso descrito hasta que quede completamente incoloro. Los sobrenadantes se conservaron en un mismo tubo falcon y finalizadas las extracciones se aforó a un volumen de 40 mL con el solvente. Se midió la absorbancia del sobrenadante a 525 nm.
La cantidad de antocianinas totales por gramo de tejido seco se expresó como miligramos de cianidina-3-glucósido, aplicando la ecuación 6.
C= (A ε) ( Vol. 1000) (PM) ( 1 Peso muestra) (10 3 ) [6] Donde,
C: Concentración de antocianinas totales (mg/g)
A: Absorbancia máxima
Ɛ: Absortividad molar de la cianidina-3-glicósido (25955 cm-1M-1)
Vol.: Volumen total del extracto de antocianinas
33 3.4.4. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE TOTAL
3.4.4.1. Determinación de Capacidad Antioxidante Total por el método ABTS∙+
La capacidad antioxidante se determinó en los extractos etanólicos por
espectrofotometría basándose en la decoloración del radical ABTS∙+ [2,2 '-
azinobis-(ácido3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico], de acuerdo a la metodología de Re et al. (1999).
Para formar el radical ABTS∙+, se preparó 25 mL de ABTS∙+ a una
concentración de 7 mM con persulfato potásico 2.45 mM, diluido en agua destilada, la mezcla se dejó en reposo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 16 horas.
Para el análisis se diluyeron 2300 μL del radical ABTS∙+en 160 mL de etanol
al 96%, se agitó 30 min antes de medir su absorbancia a 734 nm en un espectrofotómetro Génesis 20-Thermo Spectronic. La solución se reguló
añadiendo cantidades de ABTS∙+concentrado y/o etanol hasta alcanzar una
absorbancia de 0.700 ± 0.005.
Para la determinación de la capacidad antioxidante se colocaron 1000 μL de
la dilución del radical ABTS∙+en tubos de ensayo, se añadió20 μL y 10 μL
de extracto de camote cocido y fresco respectivamente, se homogenizó en un agitador vortex y se dejó reposar por 6 minutos cubierto con Parafilm®M transparente a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo se procedió a medir la absorbancia a 734 nm. Para la muestra blanco se sustituyó el extracto por etanol.
Se realizó una curva de calibración usando trolox (6-hidroxi-2,5,7,8
tetrametilcromo-2 ácido carboxílico) 0.5 mM como antioxidante sintético de
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de trolox y los resultados se expresaron como μmol de trolox por gramo de
tejido seco. Este ensayo de determinación de capacidad antioxidante se
realizó por triplicado para cada extracto.
3.4.4.2. Determinación de Capacidad Antioxidante Total por el método DPPH∙
La capacidad antioxidante se determinó por espectrofotometría en los extractos etanólicos través de la reacción con el radical estable DPPH∙ (2, 2- Difenil-1-picrilhidrazil) de acuerdo al procedimiento descrito por Brand, Cuvelier, & Berset (1995).
Se preparó 500 mL de DPPH∙ a una concentración de 40 mg/L en etanol al 96%, la mezcla se dejó en agitación durante 5 horas y después en reposo durante 24 horas antes de su uso.
Para el análisis se diluyeron 150 mL del radical DPPH∙en 46 mL de etanol y
se dejó en agitación durante 30 min antes de medir su absorbancia a 515 nm en un espectrofotómetro Thermo Scientific Genesys 20. La solución se
reguló añadiendo cantidades de DPPH∙ concentrado y/o etanol hasta
alcanzar una absorbancia de 0.800 ± 0.005.
Se tomó alícuotas de 30 μL y 10 μL de extracto de muestras de camote fresco y cocido, respectivamente, añadiendo etanol hasta alcanzar un volumen de 250 μL y finalmente se añadió 1 mL de una solución de DPPH∙, el volumen final de la reacción fue de 1250 μL. Se homogenizó en un agitador vortex y se dejó en reposo por 20 minutos para los extractos de muestras fresca y 30 minutos para los extractos de muestras cocidas cubierto con Parafilm®M transparente a temperatura ambiente, el tiempo de reposo permite que la reacción alcance un nivel estable determinado por la
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cinética de reacción previamente realizada. Transcurrido el tiempo se procedió a medir la absorbancia a 515 nm.
Se realizó la curva de calibración usando alícuotas entre 20 y 120 μL (cada
10 μL) de trolox 0.2 mM hasta alcanzar un volumen final de la reacción de
1250 μL. Los resultados se expresaron como μmol de trolox por gramo de tejido seco. Este ensayo de determinación de capacidad antioxidante se realizó por triplicado para cada extracto.