2.2.1. Dependencia del fotoperiodo
En condiciones normales de crecimiento de día largo (16 h luz / 8 h oscuridad), las plantas de la línea mutante oas-b no mostraron un fenotipo diferencial a la línea silvestre; sin embargo, las plantas de la línea mutante cs26 crecidas también en condiciones de día largo mostraron una reducción significativa de su tamaño y hojas de color verde pálido (Figura 20A).
cs26 wt A. B. LMA (g/m2) wt cs26 LD 10,2 ± 1,2 7,5 ± 0,5 SD 9,8 ± 1,5 10,8 ± 1,1 C.
Figura 20. Características fenotípicas de la línea cs26.
A: Hojas de plantas crecidas en condiciones de día largo durante 3 semanas. B: Hojas de plantas crecidas en condiciones de día corto durante 5 semanas.
C: Peso específico foliar (LMA) de cada línea. Se realizó el cálculo de las dos líneas para cada fotoperiodo utilizando cinco réplicas de hojas. LD: día largo, SD: día corto.
Se calculó el peso fresco de las plantas del mutante cs26, resultando que éste era sólo el 24 % del peso fresco total de las plantas de la línea silvestre en condiciones de ciclo largo. Además, se realizó el cálculo del peso específico foliar (proporción entre el 98
Resultados
peso seco de la hoja y su área) de cada línea, siendo para cs26 de aproximadamente un 75 % del correspondiente a la línea silvestre en ciclo largo (Figura 20C). En condiciones de ciclo corto (8 h luz / 16 h oscuridad) no hay diferencias significativas con respecto a silvestre. Para verificar que el fenotipo observado en la línea de cs26 era debido sólo a la mutación del gen CS26, esta línea se complementó usando el fragmento completo de cDNA (descrito anteriormente), generándose la línea complementada cs26::P35S-CS26, recuperándose el fenotipo silvestre cuando se crecía en condiciones de día largo (Figura 21A).
Las características fenotípicas de las plantas mutantes cs26 eran dependientes del régimen de luz. De este modo, cuando estas plantas crecían bajo un régimen de luz continua exhibían una mayor reducción en tamaño y una mayor palidez en el color de las hojas (Figura 21B). Sin embargo, en condiciones de fotoperiodo de día corto, el mutante cs26 es fenotípicamente indistinguible de las plantas silvestres, de la línea complementada y del mutante oas-b. También se observó que las plantas mutantes crecidas en medio MS con sacarosa y fotoperiodo de día largo mostraron un fenotipo similar a las plantas de la línea silvestre.
cs26::P35S-CS26 cs26 oas-b wt
A.
B.
wt cs26 cs26::P35S-CS26 oas-b LD SDFigura 21. Fenotipo de los mutantes cs26 y oas-b, así como de la línea complementada cs26::P35S- CS26.
A. Plantas crecidas en tierra en condiciones de día largo (LD) y día corto (SD) durante 3 y 4 semanas, respectivamente.
B. Plantas crecidas en tierra en condiciones de luz contínua durante 4 semanas.
2.2.2. Condiciones de sequía
Las plantas de la línea mutante cs26 crecidas en condiciones de día largo mostraron resistencia a desecación cuando éstas se dejaron de regar, en comparación con las plantas de la línea silvestre, observándose ya una diferencia significativa tras 8 100
Resultados
días sin riego. Las plantas mutantes oas-b mostraron el mismo comportamiento que las silvestres. Cuando se vuelve a regar a los 13 días de sequía, donde ya se observan los síntomas de decaimiento y clorosis, las plantas cs26 fueron capaces de recuperarse mostrando un aspecto sano, al contrario que las plantas de la línea silvestre (Figura 22A). wt cs26 0 10 Tiempo(días) 14 18 21 - AGUA + AGUA 0 8 10 13 16 Tiempo (días) - AGUA + AGUA wt cs26 A. B.
Figura 22. Respuesta a sequía de las líneas silvestre y mutante cs26.
A. Plantas crecidas en tierra en condiciones de día largo. Las plantas crecidas durante 3 semanas dejaron de regarse durante 13 días, a partir del cual volvieron a ser regadas.
B. Plantas crecidas en tierra en condiciones de día corto. Las plantas crecidas durante siete semanas dejaron de regarse durante 18 días, a partir del cual volvieron a ser regadas.
En condiciones de ciclo corto (Figura 22B) se observó un comportamiento similar, aunque menos acusado que en ciclo largo. Las plantas se dejaron de regar durante 18 días, observándose que el mutante cs26 permanecía más saludable que la línea silvestre. Al igual que lo observado en ciclo largo, cuando se volvió a regar, se observó una recuperación de las plantas cs26, pero no de las silvestres. El mutante oas-b mostró el mismo comportamiento que la línea silvestre.
En relación con estos datos obtenidos, se estudió la apertura estomática en cada una de las líneas en condiciones de día largo y día corto. La apertura del poro está controlada por el estado de turgencia de las dos células guardas, que depende de factores ambientales (humedad, luz, CO2), así como cambios hormonales en los niveles
de ABA y auxinas(Roelfsema y Hedrich, 2005; Vavasseur y Raghavendra, 2005). Se determinó la apertura estomática de las hojas incubadas en presencia de diferentes estímulos: como estímulo de apertura de estomas se usó una solución que contenía cloruro de calcio y como estímulo de cierre de estomas se usó una solución que contenía ácido abscísico (ver materiales y métodos).
En condiciones de ciclo largo se observó que en las plantas de la línea mutante
cs26 la apertura estomática es significativamente menor que en el caso de las plantas de
la línea silvestre tanto en presencia del estímulo de cierre, como con el de apertura, mientras que en condiciones de ciclo corto, no se observaron diferencias significativas (Figura 23). Estos datos parecen indicar que la resistencia a sequia de cs26 en día largo puede ser debido a una menor apertura de los estomas.
0 1 2 3 4 5 6 + ABA + Ca+2 A p er tu ra ( µm) wt oas-b cs26 * * 0 1 2 3 4 5 6 + ABA + Ca+2 A p er tu ra ( µ m ) wt oasb cs26 A. B. +Ca+2 +Ca+2 *
Figura 23. Apertura estomática en epidermis de hojas de plantas crecidas en condiciones de ciclo largo (A) y ciclo corto (B).
Las medidas se realizaron incubando las hojas en presencia de ácido abscísico, como estimulo de apertura, y en presencia de cloruro de calcio, como estímulo de cierre. Los valores son medias ± SD de 50 determinaciones. (*P < 0,05).