3.1. Cuantificación de pigmentos fotosintéticos
Para la determinación de clorofila total en la fracción de los cloroplastos se preparó una dilución 1/100 en acetona a partir de la solución enriquecida de cloroplastos en la solución II (ver apartado 5.1.3), y se centrifugó a 2500 g durante 5 min. Para la 55
determinación en hojas, se extrajo 0,1 g de peso fresco de hojas con acetona. La densidad óptica se midió a 652 nm, considerando un coeficiente de extinción de 34,5 mg-1mL-1 cm-1. El contenido de clorofila a/b y carotenoides se llevó a cabo siguiendo el protocolo descrito en trabajos previos (Lichtenthaler, 1987).
3.2. Análisis de la eficiencia fotosintética
3.2.1. Cuantificación de la emisión de fluorescencia de clorofila in vivo mediante “Fluorimager”
Las imágenes de fluorescencia de clorofila en plantas enteras in vivo se obtuvieron mediante un “chlorophyll fluorescent imaging system” (Fluorimager, Technologica). Se aplicó un régimen programado de tiempos de exposición de luz actínica (150 y 800 µmol m-2 s-1), pulsos de luz saturada y periodos de oscuridad. Mediante el software se realizaron automáticamente el cálculo de los parámetros descritos en la Tabla 3 (Baker, 2008). qL fue calculado después de las medidas a partir de las imágenes obtenidas de Fq’/Fm’, Fo’, y F’.
Tabla 3. Parámetros fotosintéticos utilizados en el estudio de la reacción fotoquímica del PSII mediante Fluorimager.
PSII: Fotosistema II. QA: aceptor quinona primario del PSII.
Parámetro Definición Relevancia Fisiológica
F, F' Emisión de fluorescencia de hojas adaptadas a la oscuridad o a la luz, respectivamente
Proporciona poca información
F0, F0' Fluorescencia mínima de hojas adaptadas a la oscuridad y a la luz, respectivamente
Nivel de fluorescencia cuando QA está oxidada al máximo
Fm, Fm' Fluorescencia máxima de hojas adaptadas a la oscuridad y a la luz, respectivamente
Nivel de fluorescencia cuando QA está reducida al máximo
Fv, Fv' Fluorescencia variable de hojas adaptadas a la oscuridad y a la luz, respectivamente
Demuestra la capacidad del PSII de realizar la reacción fotoquímica
Fq' Diferencia en fluorescencia entre
Fm' y F'
Extinción de fluorescencia fotoquímica
Fv/Fm Eficiencia cuántica máxima del
PSII Eficiencia máxima a la cual la luz absorbida por el PSII es usada para la reducción de QA
Materiales y métodos
Parámetro Definición Relevancia Fisiológica
Fq'/Fm' Eficiencia operativa del PSII Estima la eficiencia a la cual la luz absorbida por el PSII es usada para la reducción de QA
Fv'/Fm' Eficiencia máxima del PSII Estimación de la eficiencia máxima
de la reacción fotoquímica del PSII a una PPFD dada. Es la eficiencia de operación del PSII si todos los centros estuviesen abiertos (QA oxidada)
Fq'/Fv' Factor de eficiencia del PSII También llamada qP. Relaciona la
eficiencia máxima del PSII con la eficiencia operativa del PSII
NPQ Non-photochemical Quenching
(decaimiento no fotoquímico) Monitoriza la constante de velocidad aparente de pérdida de calor del PSII
qL Fracción de centros del PSII que
están "abiertos" Estima la fracción de los centros abiertos del PSII (con QA oxidada) 3.2.2. Análisis fotosintético mediante intercambio de gases y fluorescencia de
clorofila
Para medir los parámetros de fluorescencia de clorofila también se utilizó un analizador de intercambio de gases “Li-6400 Infra Red Gas Analizer” (Licor Inc.). Las hojas no escindidas de la planta fueron expuestas a PPFD 750 µmol m-2 s-1 durante 45 minutos usando una fuente de luz blanca que incidía sobre un área total de 2 cm2. La temperatura de la cámara del IRGA se mantuvo constante a 22 ºC. El programa utilizado para obtener las medidas de fluorescencia contenía un periodo de oscuridad de 20 minutos, seguido de periodos de luz actínica y de pulsos de luz saturados, tomándose medidas cada 2 minutos, durante 6 ciclos. El cálculo de los parámetros Fv/Fm, Fq’/Fm’,
Fv’/Fm’, y NPQ se realizó automáticamente mediante el software de LICOR.
Los parámetros de intercambio de gases fueron determinados de forma simultánea con las medidas de fluorescencia de clorofila usando el mismo equipo Li- 6400. Todas las medias fueron realizadas en la misma hoja a una temperatura de 22 ºC usando una cámara de hoja de 2 cm2. Las curvas AN-Ci fueron obtenidas en diferentes
hojas de las líneas mutante y silvestre. En hojas adaptadas a la oscuridad, la fotosíntesis fue iniciada con una concentración de CO2 (Ci) de 400 µmol mol-1 y una PPFD de 1000
µmol m-2 s-1. La cantidad de luz azul fue ajustada a 10 % de PPFD para maximizar la apertura de los estomas. La temperatura de la cámara fue mantenida a 22 ºC, con un 57
déficit de presión de vapor entre 1,2 y 1,8 kPa. Una vez que se alcanzó el equilibrio, se determinaron las curvas de respuesta a CO2. Las medidas de intercambio de gases y
fluorescencia se realizaron a 400 µmol CO2 mol-1 aire, y posteriormente la
concentración de CO2 se redujo secuencialmente hasta 50 µmol CO2 mol-1 aire. Una vez
finalizadas las medidas a bajo CO2 se retorno a 400 µmol CO2 mol-1 aire y se fue
incrementando la concentración Ci secuencialmente hasta 1500 µmol mol-1. La
corrección de posibles fugas de la cámara de medida se realizó en tres curvas AN-Ci, dos
de ellas con la cámara vacía y una de ellas con hojas fotosintéticamente inactivas obtenidas por calentamiento a 100 ºC hasta que no se observó fluorescencia en la hoja. En las curvas de luz (AN-PAR), las hojas no escindidas de la planta fueron expuestas a
un programa donde se utilizó diferentes intensidades lumínicas desde 0 a 2000 µmol m-2 s-1, a una temperatura constante de 22 ºC y 400 μmol CO2 mol-1 aire. El cálculo de los
parámetros de conductancia estomática, tasa fotosintética, Ci, Fv/Fm, Fq’/Fm’,
Fv’/Fm’, NPQ, etc., se realizó automáticamente mediante el software de LICOR (Tabla
4).
Tabla 4. Parámetros fotosintéticos utilizados en el estudio del intercambio de gases y fluorescencia de la clorofila del PSII mediante IRGA.
Parámetro Definición
AN
Tasa fotosintética neta (μmol CO2 m-2 s-1) o tasa neta de incorporación
de CO2
gs Conductancia de CO2 estomática (mol CO2 m-2 s-1)
gm Conductancia de CO2 del mesófilo (mol CO2 m-2 s-1 bar-1)
E Transpiración (mmol H2O m-2 s-1)
α Absorbancia de la hoja
β Refleja la distribución de los electrones entre cada uno de los
fotosistemas PSI y PSII
Ci Concentración de CO2 intercelular (μmol CO2 mol-1)
Ca Concentración de CO2 ambiental (μmol CO2 mol-1)
Cc Concentración de CO2 en el cloroplasto (μmol CO2 mol-1)
Vc,max Velocidad máxima de carboxilación de la Rubisco (μmol CO2 m-2 s-1)
Jmax Tasa de transporte de electrones máximo (μmol e- m-2 s-1)
Materiales y métodos
Parámetro Definición
ETR Tasa de transporte de electrones (μmol e- m-2 s-1)
Г* Punto de compensación de CO2 en ausencia de respiración mitocondrial
Rday Tasa de respiración mitocondrial (μmol CO2 m-2 s-1)
Rendimiento cuántico
Concentración de CO2 asimilado por cada mol de fotones de luz (μmol
CO2 mol-1 hυ)
PAR-abs Radiación fotosintéticamente activa que es absorbida por la hoja
(μE m-2 s-1)
PAR-abs/ETR Concentración de fotones de luz necesarios para la conversión de 1 mol
de electrones (mol E mol-1 e-)
4. Aislamiento y análisis de ácidos nucleicos