El poder reductor generado por la cadena de trasferencia de electrones fotosintético es utilizado tanto para llevar a cabo reacciones anabólicas del metabolismo como para generar sistemas antioxidantes en la célula (producción de antioxidantes solubles como ascorbato y glutatión) y sistemas regulatorios redox. Todos ellos están interconectados y forman parte de una red de procesos químicos de oxido-reducción. 42
Introducción
En el estroma cloroplástico existen cuatro rutas importantes en cuanto a la regulación redox como son las que implican directamente a los donadores de electrones ferredoxina y NADPH, o los que implican proteínas reguladoras como los sistemas de tiorredoxinas (Txr), o el sistema glutatión/glutarredoxina (Dietz y Pfannschmidt, 2011).
Las tiorredoxinas son pequeñas oxidorreductasas muy abundantes de aproximadamente 12 kDa con un sitio activo conservado (W-C-G(P)-C) y una estructura tridimensional común. En Arabidopsis se han encontrado más de 20 genes que codifican tiorredoxinas. Basándose en su estructura, pueden ser clasificadas en seis clases: Trx-h (citosólica y parcialmente mitocondrial), Trx-o (mitocondrial), Trx-f, -m, -
x, e -y (plastídicas) (Oelze et al., 2008). Las tiorredoxinas son reducidas por enzimas
específicas denominadas Fd-Trx-oxido-reductasa (FTR), catalizando la reducción de un grupo ditiol conservado en la Trx que es luego utilizado por la molecula de Trx para transferir el poder reductor a la proteína diana específica, funcionando como transmisores redox. Recientemente se ha identificado la proteína NTRC que actúa como tiorredoxina reductasa dependiente de NADPH y que es esencial en el control redox en plastidios (Perez-Ruiz et al., 2006; Michalska et al., 2009).
Las tiorredoxinas reducen proteínas dianas a través de puentes difulfuro y a menudo producen cambios en el estado de activación de estas proteínas (Lemaire et al., 2007). En términos de la regulación redox celular, el sistema ferredoxina-tiorredoxina es el ejemplo clásico mejor estudiado de control de actividad enzimática dependiente de puentes de disulfuro. Existen al menos seis enzimas del ciclo de Calvin que han sido identificadas que se activan tras iluminación, incluida la Rubisco activasa. Dos tipos de Trx (-f y –m) han sido identificadas como reguladores clave de esta cascada de señalización por luz a través de un mecanismo que involucra la activación/desactivación de enzimas mediante intercambios tiol/disulfuro (Lemaire et al., 2007).
Además de su papel como reguladores de procesos metabólicos ajustando el estado redox de las proteínas dianas, también participan en mecanismos de defensa antioxidantes como donadores de electrones a peroxirredoxinas (Prx). Las peroxirredoxinas son peroxidasas sin grupo hemo ubicuas localizadas en diferentes compartimentos celulares. En Arabidopsis existen 10 posibles genes que codifican para Prx, cuatro de las cuales se localizan en el cloroplasto (2-Cys Prx A y B, Prx Q y PrxII E) (Dietz, 2003). El centro catalítico de las Prx contiene un residuo cisteinil que reduce a diferentes peróxidos conduciendo a la formación de enlaces disulfuros intra- o intermolecular en la Prx o entre dos subunidades de Prx, excepto en el caso de 1-Cys Prx. Las tiorredoxinas y las glutaredoxinas reducen los tioles oxidados y así regenera la Prx activa. A parte de su papel como defensa antioxidante, también se ha sugerido que las Prx tienen un papel importante en la señalización redox (Dietz et al., 2006).
La regulación redox del lumen tilacoidal muestras características opuestas al estroma cloroplástico que puede ser motivo de su origen evolutivo. El espacio intermembrana de la mitocondria y del lumen tilacoidal cloroplástico son descendientes evolutivos del espacio periplásmico de bacteria y por este motivo la oxidación de puentes disulfuros de los residuos de cisteína es utilizado como mecanismo para estabilizar el plegamiento de las proteínas y regular su función (Hermann et al., 2009). Este proceso es opuesto a los otros compartimentos de las células eucarióticas como el estroma, que derivan del citosol bacteriano y que mantiene los residuos de cisteína principalmente reducidos.
El lumen tilacoidal contiene una gran variedad de proteínas entre las que se encuentran numerosas chaperonas e inmunofilinas con actividad PPIasa (peptidil- propil-cis-trans isomerasa). La primera inmunofilina cloroplástica identificada fue FKBP13 en plantas de haba (Luan et al., 1994). Esta proteína fue después caracterizada bioquímica y genéticamente en Arabidopsis y en el lumen tilacoidal interacciona con la proteína de Rieske (Gupta et al., 2002). La estructura tridimensional de AtFKBP13 revela un par de enlaces disulfuro únicos que están ausentes en los homólogos bacterianos y animales. Los experimentos revelan que las tiorredoxinas del cloroplasto (tipo -m) o de E. coli reducen específicamente ambos puentes disulfuro en concierto con la pérdida de actividad PPIasa. Estos resultados sugieren que la proteína luminal AtFKBP13 imita a su pareja estromática en la modulación tiol-redox. Sin embargo, el lumen difiere del estroma en el hecho fundamental de que la activación de las enzimas tiene lugar por oxidación en la luz (Figura 7) (Gopalan et al., 2004; Buchanan y Luan, 2005).
Hasta la fecha no se han identificado en el lumen enzimas con actividad sulfidril oxidasas capaces de catalizar la oxidación de proteínas, aunque este proceso podría tener lugar de forma no enzimática e incontrolada debido a la alta concentración de oxígeno que se produce en el lumen durante la fotosíntesis.
Introducción
Figura 7. Mecanismo propuesto para la regulación mediada por luz en el estroma y lumen tilacoidal.
Trx: tiorredoxina; PSI: fotosistema I; PSII: fotosistema II; “Redox protein”: proteína no identificada hasta la fecha (Gopalan et al., 2004).
Esta regulación funcional de proteínas por procesos de oxidación también tiene lugar en otras proteínas esenciales como la proteína quinasa STN7 de Arabidopsis o STT7 de Chlamydomonas. Esta proteína STN7/STT7 está asociada con la membrana tilacoidal y regula los niveles de fosforilación de las proteínas LHCII en respuesta a condiciones cambiantes de luz para ajustar la composición de los fotosistemas PSII y PSI. La actividad quinasa está regulada por el estado redox de los residuos de cisteína conservados en el extremo N-teminal de la proteína, que se localizan en el lado del lumen, siendo activa con los residuos oxidados e inactiva con los residuos reducidos (Lemeille et al., 2009; Pesaresi et al., 2009). Se ha propuesto que estos residuos de cisteína están implicados en la inactivación de las quinasas por un sistema de tiorredoxinas que transmita la señalización redox del estroma al lumen. En este proceso estarían implicadas posiblemente las proteínas tilacoidales CCDA y HCF164 (Puthiyaveetil et al., 2011). La proteína HCF164 fue identificada como una proteína Trx-like anclada en la membrana tilacoidal que presenta su extremo catalítico en el lumen. HCF164 está relacionada con el ensamblaje del complejo Cytb6f (Lennartz et al., 2001) y tiene como proteína diana a PsaN (subunidad N del PSI). CCDA es un homólogo de los transportadores procarióticos tiol-disulfuro y es imprescindible para una transferencia de electrones eficiente desde el estroma al lumen (Motohashi y
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Hisabori, 2010). El modelo sugiere que CCDA recibe los electrones de la Trx-m estromática y los dona a HCF164 que reduce las proteínas diana en el lumen.