Breadth and depth of the curriculum: Its influence on the decision concerning the use of PT services

Debido a que el estudio de expresión diferencial de genes mediante microarrays no aportó información clara sobre las rutas de regulación ejercidas por los sistemas AbrA1/A2 y AbrC1/C2/C3, se decidió abordar el estudio de los TCSs in vitro. El objetivo final era la identificación de las dianas moleculares de los RRs mediante diferentes ensayos que se detallarán en los apartados 1 y 2 de la segunda parte de este capítulo. Para poder realizar estas aproximaciones in vitro se requerían las proteínas RRs purificadas y activas (fosforiladas).

En principio, con objeto de obtener proteínas funcionales, se procedió a la superproducción de las proteínas reguladoras, AbrA2 y AbrC3, en la cepa silvestre S. coelicolor M145. Para ello se utilizaron los vectores pTXabrA2 y pNXabrC3 en los que la expresión de las proteínas quedaba controlada bajo el promotor inducible xysAp y además quedaban etiquetadas con una cola de 6 histidinas en su extremo C-t (apartado 3.2. del capítulo I.1. de resultados). Para examinar la producción del regulador AbrA2, la cepa wt.pTXabrA2 y la cepa control (portadora del plásmido vacío) se crecieron en cultivos líquidos de 10 ml en medio mínimo NMMP (donde se sabía que se expresaba de forma natural el RR) y en medio complejo YES (utilizado rutinariamente en el laboratorio para la expresión de proteínas en Streptomyces (Diaz, 2008), ambos suplementados con tioestreptona 5 µg/ml y xilosa 1 % para inducir la expresión del RR por el promotor xysAp. Se cogieron muestras a diferentes tiempos y se obtuvieron los extractos de las proteínas correspondientes analizándolas posteriormente en geles de poliacrilamida. En medio NMMP se producía una mayor cantidad respecto al YES (figura R.28.A) pero en ambos casos los resultados fueron poco satisfactorios, debido a la escasa cantidad de proteína producida (sólo detectable por western-blot). El seguimiento de la producción de AbrA2 en los cultivos a distintos tiempos y la posterior separación de las fracciones solubles de las insolubles (ver materiales y métodos) permitió comprobar que toda la proteína se quedaba en la fracción insoluble (figura R.28.B). Debido a la escasa producción y al problema de insolubilidad se desestimó la purificación de este regulador a partir de cultivos de

Resultados

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En cuanto a la sobreexpresión del regulador abrC3 en S.coelicolor M145 utilizando el plásmido pNXabrC3, como se ha explicado con detalle en el apartado 3.2.2 de resultados (capítulo I.1.), resultó muy perjudicial para el crecimiento de los microorganismos (figura R.18.) y no fue posible crecer cultivos líquidos de estas cepas.

A.

B.

Figura R.28. (A) Detección de la proteína AbrA2-His mediante western-blot con anticuerpos anti-His en los

medios de cultivo NMMP y YES tras 60 horas de incubación. (B) Solubilidad del RR AbrA2-His mediante detección de la proteína por western-blot con anticuerpos anti-His de cultivos líquidos NMMP crecidos a diferentes tiempos. (La cantidad de proteínas cargadas por carril equivalen a 1,3 mg de micelio).

Por los motivos expuestos se decidió obtener los RRs en E. coli, aunque ello implicaba la necesidad de una posterior fosforilación de las proteínas purificadas para que se encontrasen en su conformación activa. La construcción de todas las proteínas recombinantes en E. coli utilizadas a lo largo de esta tesis doctoral, se ha llevado a cabo utilizando el vector pET22(b) (materiales y métodos). El DNA codificante de los RRs AbrA2 y AbrC3 se amplificó por PCR utilizando los oligonucleótidos AY-047/AY-048 y SER-001/SER-002, respectivamente (apéndice 1). Los fragmentos amplificados y digeridos se clonaron en los sitios NdeI/XhoI de la región polilinker del plásmido pET22(b), quedando ambas proteínas etiquetadas con una cola de 6 histidinas en el extremo C-t. Tras la transformación de E. coli BL21 (DE3) con los plásmidos construidos en la cepa E. coli DH5α, pETabrA2 y pETabrC3 (materiales y métodos, tabla M.3), se indujo la expresión de ambas proteínas en cultivos líquidos mediante la adición de IPTG 1 mM. Los cultivos se incubaron aproximadamente durante 4 horas más y luego se procedió a la purificación de las proteínas mediante cromatografía de afinidad de metales, utilizando con como matriz agarosa Ni-NTA, tal y como se detalla en materiales y métodos, 7.2.1.

Como puede observarse en la figura R.29. se obtuvo una buena inducción de la producción de ambos reguladores (carril I), sin embargo, el RR AbrA2 (24 kDa) resultó altamente insoluble (figura R.29.A), como había ocurrido en la expresión en Streptomyces, encontrándose en una proporción muy pequeña en la fracción soluble (carril FS), por lo que la cantidad de proteína

NMMP YES NMMP YES Fracción soluble 24h 32h 48h 55h 72h 24h 32h 48h 55h 72h Fracción insoluble Fracción soluble 24h 32h 48h 55h 72h 24h 32h 48h 55h 72h Fracción insoluble

purificada fue muy escasa. Para conseguir mayor cantidad de proteína soluble y optimizar consecuentemente la purificación, se ensayaron diferentes condiciones de expresión, disminuyendo la cantidad de IPTG añadido (a 0,5 mM) y la Tª de incubación hasta 16º C pero en ningún caso se obtuvo una mejora en el rendimiento. También se probó a expresar la proteína con la etiqueta GST, e incluso sin etiqueta, pero todas sus formas resultaron altamente insolubles. Por último, se intentó purificarla en condiciones desnaturalizantes (con urea 8M en todos los buffers de purificación) pero al eliminar la urea progresivamente del buffer de diálisis, para la renaturalización de la proteína, ésta volvía a precipitar. Estos resultados negativos no se muestran en la memoria. En el caso del regulador AbrC3 (25,12 kDa), se encontraba mayoritariamente en la fracción soluble tras la lisis celular (Fig. R.29. B- carril FS) por lo que su purificación se llevó a cabo con éxito (Figura R.29.B).

A. B.

Figura R.29. (A) SDS-PAGE 15 % de las fracciones de purificación de AbrA2 (24 kDa) y AbrC3 (25,12 kDa)

(B). MW: marcadores de peso molecular. NI: cultivo no inducido. I: cultivo inducido. FI: fracción insoluble. FS: fracción soluble. FNR: fracción no retenida. L1-L3: lavados 1-3 (20 mM imidazol). E: fracción eluída (1M imidazol). Para la visualización de las proteínas se hizo una tinción con coomassie. En todos los carriles se cargaron cantidades equiparables de proteínas.

Las fracciones eluídas se dializaron y se cuantificó la cantidad de proteína obtenida (ver materiales y métodos, 7.4.) llegando a tener una concentración de 0,05 µg/µl en el caso del RR AbrA2 y 0,94 µg/µl de la proteína AbrC3.

2. FOSFORILACIÓN DE LOS RRs CON FOSFODONADORES DE