development of pupils and the decision concerning PT use
4.1.3. The curricular issues and mathematics
Los RRs igual que las HKs son proteínas modulares, las cuales tienen dos dominios bien definidos, un dominio receptor donde se sitúa el sitio de fosforilación (REC) y un dominio efector, de unión a DNA (DBD: DNA Binding Domain) en los casos que nos ocupan. Este tipo de proteínas se presentan en dos estados, uno defosforilado e inactivo y otro fosforilado y activo. Se ha descrito que generalmente, el estado fosforilado de éstas les permite cambiar su
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conformación, dimerizar y unirse con afinidad a sus regiones diana del DNA al quedar el dominio DBD accesible (representado en la figura R.30.).
Figura R.30. Representación del cambio
conformacional de un RR tras la fosforilación (el símbolo P representa el fosfato). Se muestra como en su conformación abierta y consecuentemente activa puede dimerizar y unirse al DNA. El cilindro verde corresponde al dominio C-t REC y el cilindro amarillo corresponde al dominio de unión a DNA (DBD).
Por este motivo, el principal objetivo perseguido fue lograr que las proteínas RRs se fosforilasen y adquiriesen la conformación adecuada para ser completamente funcionales y así, poder utilizarlas en los experimentos de búsqueda de dianas moleculares. En principio y siguiendo las pautas descritas en otros trabajos de investigación (Lukat et al., 1992; Zapf et al., 1996), se emplearon fosfodonadores de bajo peso molecular y se llevaron a cabo reacciones de fosforilación in vitro con los dos RRs AbrA2 y AbrC3 purificados de E. coli, según se describe en materiales y métodos (apartado 7.5.1.). En estas reacciones se utilizaron los fosfodonadores acetilfosfato, carbamoilfosfato y fosforamidato, en distintas concentraciones (20, 100 y 150 mM). Como control de fosforilación (figura R.31.A) se utilizó la proteína truncada DrrBN que
fue amablemente proporcionada por la Dra. Anne Marie Stock (New Jersey). Esta proteína corresponde al extremo N-t del RR DrrB, un regulador de respuesta del microorganismo
Thermotoga maritima (Robinson, 2003). Cada reacción se incubó a una temperatura de 37º C
durante 30 minutos, tras la cual se llevó a cabo una electroforesis SDS-PAGE a 4º C para evitar la disociación del fosfato. Finalmente, para visualizar los resultados se realizó una tinción específica de proteínas fosforiladas (Phos-tag, Perkin Elmer), en las que las bandas fosforiladas se observan por la emisión de fluorescencia bajo la luz UV. Posteriormente se realizó una tinción con coomassie para monitorizar la cantidad de proteína presente en los geles. En la figura R.31. se muestran los resultados de las reacciones de fosforilación con los fosfodonadores a una concentración 20 mM, ya que son idénticos a los obtenidos con mayores concentraciones de sustrato.
A. B. C.
Figura R.31. Resultados de la reacción de fosforilación de los RRs DrrBN (A), AbrA2 (B) y AbrC3 (C). Los fosfodonadores acetilfosfato, carbamoilfosfato y fosforamidato están representados por “A”, “C” y “P.A.” respectivamente, y su ausencia se indica con el signo “-“. Las imágenes superiores son resultado de la tinción Phos-tag y las inferiores de la tinción con coomassie.
Los resultados mostraron que la proteína control DrrBN se fosforilaba sin problema con
cualquiera de los fosfodonadores utilizados (apreciado por la señal fluorescente de la banda de proteína). Sin embargo, ninguno de los RRs problema, AbrC3 y AbrA2, emitía fluorescencia alguna tras el tratamiento (figura R.31. B y C). Esto podía deberse a tres motivos, (1) que los fosfodonadores utilizados no fueran capaces de donar el fosfato a los RRs (2) que el dominio receptor del fosfato de los RRs no se encontrara asequible y la fosforilación se inhibiese por una interacción conformacional con sus dominios efectores o (3) que la vida media de los RRs fosforilados fuese demasiado corta para apreciarla en este tipo de ensayos.
Para intentar discernir cuál era el motivo del resultado obtenido, se construyeron unas formas truncadas de los RRs que únicamente constaban del dominio N-t de las proteínas (similar a la proteína DrrBN utilizada como control en los ensayos), ya que se ha comprobado en
varios trabajos que el dominio receptor aislado de los RRs, es capaz de fosforilarse con mayor eficiencia que la proteína entera al no estar sometido a ningún tipo de inhibición por interacción de dominios (Robinson et al., 2003). Las proteínas truncadas de ambos RRs, carentes del dominio efector C-t se denominaron: AbrA2N: 141 aas (15,2 kDa) y AbrC3N: 137 aas (15,5
kDa) (figura R.32.). El DNA codificante del extremo N-t de las proteínas se amplificó por PCR con los oligonucleótidos AY-047 e AY-102 (apéndice 1), para AbrA2N y con los
oligonucleótidos SER-001 y AY-089 (apéndice 1), para AbrC3N. Posteriormente se introdujeron
los fragmentos amplificados y digeridos, en los sitios NdeI/XhoI del vector pET22b, quedando también etiquetadas con cola de histidinas en el extremo C-t. Ambos RRs se expresaron en la cepa E. coli BL21(DE3) y se purificaron mediante agarosa Ni-NTA, de la misma forma en que se hizo con los RRs completos. El resultado de la purificación se muestra en la figura R.33. Las fracciones eluídas se dializaron y se cuantificaron las cantidades de proteínas obtenidas llegando a tener una concentración de 1 µg/µl en el caso del RR AbrA2N y 0,8 µg/µl de la
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Figura R.32. Alineamiento clustalX2 de los RRs AbrA2 y AbrC3. El dominio REC (dominio receptor) se
recuadra en verde. Los asteriscos indican identidad y los puntos similitud entre aminoácidos. Las flechas rojas corresponden al último aminoácido que forma parte de las formas truncadas N-t.
A. B.
Figura R.33. SDS-PAGE 18 % de las fracciones de la purificación de AbrA2N (15,2 KDa) (A) y de AbrC3N (15,5 KDa) (B). MW: marcadores de peso molecular. NI: cultivo no inducido. I: cultivo inducido. FS: fracción soluble. FNR: fracción no retenida. L1-L3: lavados 1-3 (20 mM imidazol). E: fracción eluída (1M imidazol). Para la visualización de las proteínas se hizo una tinción con coomassie.
Como puede observarse en la figura R.33. las dos proteínas AbrA2N y AbrC3N se
encontraban mayoritariamente en la fracción soluble, lo que permitió su purificación en cantidades suficientes para el ensayo de fosforilación in vitro. Una vez se dispuso de las proteínas purificadas amino-terminales truncadas, se repitieron los ensayos de fosforilación con los fosfodonadores. En los resultados obtenidos, visibles en la figura R.34. no se apreció indicio alguno de fosforilación en ninguna de las proteínas, AbrA2N o AbrC3N en ninguna de las
condiciones ensayadas. Por lo tanto, se descartó que la ausencia de fosforilación observada en los primeros ensayos se debiese a una inhibición por interacción de dominios, lo que probablemente signifique que estos RRs no son capaces de fosforilarse con acetilfosfato, carbamoilfosfato o fosforamidato. Otras posibilidades son que la fosforilación ocurra con una eficiencia muy baja o que la vida media de la fosforilación de ambos RRs sea muy corta y no puedan verse como moléculas fosforiladas con la tinción Phos-tag. En cualquier caso, el resultado se tradujo en una ausencia de proteína fosforilada.
A. B.
Figura R.34. Resultados de la reacción de fosforilación con de los RRs AbrA2N (A) y AbrC3N (B). Los fosfodonadores acetilfosfato, carbamoilfosfato y fosforamidato están representados por “A”, “C” y “P.A.” respectivamente, su ausencia se indica con el signo “-“. Las imágenes superiores son resultado de la tinción Phos-tag y las inferiores de la tinción con coomassie.
Como el objetivo de obtener RRs fosforilados para posteriores experimentos no había dado resultado mediante esta estrategia, se decidió llevarlo a cabo mediante otra alternativa: la transferencia del fosfato a los RRs desde sus HKs específicas.