Types of assessment and their impact on the decision to use PT services

Debido a que la determinación de una secuencia consenso de unión del RR AbrA2 mediante SELEX no fue posible, se decidió abordar el mismo propósito final de identificar genes diana de este RR, mediante ensayos in vitro de captura de DNA por afinidad. El objetivo se extendió también al RR AbrC3. Para ello, se utilizaron por un lado los RRs etiquetados con una cola de histidinas y fusionados a bolas magnéticas como en el experimento anterior. Por otro lado, se utilizaron como ligandos problema, fragmentos del genoma de S. coelicolor M145 (100-500 pb) resultado de una digestión parcial con la enzima de restricción Sau3A. El proceso se detalla en los siguientes apartados.

2.1. INMOVILIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS AbrA2DBD_{, AbrC3}DBD _{y AtrA}

Para esta parte del trabajo se emplearon las versiones truncadas de las proteínas reguladoras, AbrA2DBD y AbrC3DBD que mantienen teóricamente su capacidad de unión a secuencias diana del DNA. De nuevo se utilizó como control en el experimento la proteína AtrA. La inmovilización en las bolas magnéticas de todas las proteínas problema usadas como cebo en el proceso, se hizo exactamente en las mismas condiciones que en el experimento del SELEX explicado en los apartados anteriores (ver materiales y métodos).

2.2. CAPTURA DE LAS DIANAS DE LOS RRs Y CLONACIÓN DE LOS

FRAGMENTOS DE DNA EN pSK+

Para limitar el tamaño del DNA genómico que se iba a incubar con las proteínas, se llevó a cabo una digestión parcial del gDNA de S. coelicolor con Sau3A, seleccionando las condiciones en las que el tamaño de los fragmentos resultantes oscilase entre 100 y 500 pb mayoritariamente.

El experimento de captura se realizó con las proteínas problema AbrA2DBD y AbrC3DBD, con el control positivo AtrA y con un control negativo correspondiente a la proteína truncada AbrC3N (sin motivo de unión a DNA). Se inmovilizaron cantidades equimoleculares de proteína

en todos los casos y tras la incubación DNA-proteína durante 2 horas a 4º C (ver materiales y métodos), se realizaron varios lavados el mismo buffer de unión para eliminar el DNA no unido. Seguidamente se hicieron tres eluciones del DNA unido a las proteínas, aumentando progresivamente en cada elución la concentración de sales del buffer de unión: la primera con NaCl 0,1 M, la segunda con NaCl 0,3 M y la tercera con con NaCl 1 M. Las sales se eliminaron utilizando el kit de purificación y limpieza de DNA (GE Healthcare) y se clonaron los fragmentos de DNA resultantes de las eluciones 0,3 y 1 M NaCl, en el vector pSK+ previamente digerido con BamHI. Posteriormente se transformó con la mezcla de ligación la cepa E. coli

Resultados

106

DH5α y se seleccionaron los clones blancos que portaban los insertos (selección blanco-azul con X-Gal, ver materiales y métodos).

2.3. ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS RESULTANTES DE LAS CAPTURAS

El resultado de la transformación resultó similar, respecto al número de unidades formadoras de colonias (ufc) blancas obtenidas, en el caso de las proteínas problema y el control negativo, por lo que en principio se analizaron 10 secuencias de cada transformación, AbrA2DBD, AbrC3DBD, AtrA y AbrC3N,. El resultado del análisis de las secuencias fue alentador,

ya que se comprobó que aquellas que procedían de la incubación del DNA con el control negativo, no tenían ningún inserto y correspondían al vector recircularizado. El resto de los plásmidos resultantes sí tenían inserto, por ello en principio se seleccionaron 40 clones más de los obtenidos con la captura de las proteínas problema AbrA2DBD y AbrC3DBD y del control AtrA y todos ellos fueron secuenciados. Haciendo un blastn con las secuencias de los insertos se comprobó que correspondían tanto a regiones intergénicas como a regiones intragénicas del genoma, aunque la proporción entre unas y otras variaba dependiendo de la proteína de unión. En las tablas R.11, R.13 y R.14. se muestran los SCOs cuyas regiones precedentes 5´ fueron capturadas.

Al analizar las secuencias resultantes de la captura con la proteína AtrA, se seleccionaron aquellas que correspondían a secuencias intergénicas del genoma, presumiblemente promotoras, un 56 % (28/50). De estas secuencias se obtuvo una sobrerrepresentada localizada aguas arriba del SCO5461 (5461p), encontrándose en 11 clones analizados, lo que aportaba validez a la captura, además, entre los otros promotores capturados se encontró el del actII-ORF4, diana concocida de la proteína AtrA. El resto de regiones intergénicas capturadas se enumeran en la tabla R.11.

Asumiendo que entre las secuencias resultantes de la captura existen DNAs seleccionados de forma inespecífica, se quiso establecer un filtro de selección en la búsqueda de secuencias diana del regulador AtrA. El mencionado propósito se llevó a cabo gracias a las secuencias consenso de unión de AtrA previamente definidas, resultado del SELEX (GGAAn{5}CnTTCC) y del conjunto SELEX-footprinting (GGnAn{7}TTCn). Para no sesgar demasiado la selección se utilizaron dos secuencias consenso degeneradas derivadas de la secuencias consenso anteriores GGAn{0,20}TCC y GGnAn{0,20}TTC, y se hizo una búsqueda de las mismas sobre todas las regiones de DNA resultantes de la captura. La secuencias consenso degeneradas que se encontraron se muestran en la tabla R.11, no obstante, en el apéndice 2 se recogen los insertos resultantes de esta captura con AtrA en toda su extensión.

Tabla R.11. (A) Regiones promotoras resultantes de la captura de DNA con el regulador AtrA y presencia de

muestra entre paréntesis (x N) el número de veces que ese promotor salió representado en el experimento. En negrita se muestran los clones más significativos.

Tabla R.12. Región intragénica capturada con el regulador AtrA con secuencias consenso degeneradas.

Respecto a los insertos de las proteínas problema, en el caso de AbrC3DBD se identificó un porcentaje de regiones intergénicas del 58 % (29/50). Para el RR AbrA2DBD se tuvo que ampliar

AtrA Regiones

intergénicas (SCOs)

Función Secuencia degenerada GGAN{0,20}TCC o

GGnAn{0,20}TTC

5461 (x11) proteína de secreción (putativa)

(GGAGCGACGCATTCC) (GGAGGAGGGGTCCTCAGCGGTCC)

GGGAAGACCACGTGGTTC 2286/87 (x3) fosfatasa alcalina/ oxidorreductasa

(putativas) (GGAATTGCCCCCTCC) (GGACGGATGAGTTCCGGATGTTCC) GGCACCCGTGACGACGGCGACCTTC 7648 RR (TCS) (GGACCGGTCCCGGTTCCCGTTCC) 5085 actIIORF4 SI (GGACGTGTCC) (GGATGTGTAATTCCGCTTAAATCC) 1714/15 proteína de secreción/ homogentisato 1,2-dioxigenasa (putativas) (GGATCCCCCGGGGGTCTGGTTCC) (GGAGCGGAGCGGGGAAGTCC) (GGAAACCGCAATCC) 4295 (x2) proteína de choque frío

(GGAGCGCGTTCC) (GGAATTGCCCCCTCC) GGAATTGCCCCCTCCGTTTC 5502 proteína integral membrana

exporte (putativa) (GGAAGACCGGGAATGGCCGTCC)

1038 proteína hipotética (GGATCATGCTGAGACTCGGAATCC)

(GGATCTCC)

1480 proteína hipotética (GGAGGCTGACCAGGACTTTTCC)

(GGACTTGACCGCTAGTCTCC)

7791a oxidorreductasa (putativa) GGATCGAGCCATCCATCC

2442/43 gntR regulador transcripcional/

proteína de transporte (putativas) Ninguna secuencia 3522/23 regulador transcripcional

(putativa) / proteína hipotética Ninguna secuencia 3862/63 proteína membrana/proteína de

secreción (putativas) Ninguna secuencia

2125 proteína hipotética Ninguna secuencia

3219 lipasa (putativa) Ninguna secuencia

AtrA-INTRAGÉNICAS

SCO Función Secuencia degenerada GGAN{0,20}TCC o

GGnAn{0,20}TTC 4503 (x2) proteína hipotética conservada (GGATCGTCAGATAGCCCTCGTCGTCC) (GGACGACGCCCCCGGCCTGCGGGTCC) (GGACCTGCTCC)

Resultados

108

el número de clones analizados y aun así, el porcentaje de regiones intergénicas resultó ser considerablemente menor que el de AbrC3DBD, de un 27 % (20/75). La alta proporción en promotores (58 %) junto con la aparición de uno de ellos 9 veces hicieron que la captura realizada con la proteína AbrC3DBD se considerase positiva. Además entre los promotores capturados se encontró el del SCO4597, la HK AbrC2 que forma el propio sistema de tres componentes (tabla R.13.).

Con las secuencias promotoras resultantes de la captura se hizo una búsqueda de posibles secuencias consenso utilizando el programa rsa-tools, pero no se pudo determinar ninguna con alta fidelidad.

Tabla R.13. Regiones promotoras resultantes de la captura de DNA con el regulador AbrC3DBD. En la columna de los SCOs de las regiones promotoras se muestra entre paréntesis (x N) el número de veces que ese promotor salió representado en el experimento. En negrita se muestran los clones más significativos.

Respecto a captura realizada con la proteína AbrA2DBD (tabla R.14.) todos los indicios apuntaban a que los resusltados eran menos fiables debido a la baja proporción de zonas intergénicas capturadas y a la escasa repetividad de los DNAs retenidos. No obstante, en esta captura también salieron un conjunto de promotores que había que comprobar mediante otra técnica para confirmar si la unión DNA-proteína era real o eran meros artefactos. Como en el caso anterior, de las secuencias que se unían a AbrA2DBD no fue posible identificar ninguna patrón conservado común y tampoco se encontró la secuencia “consenso” determinada por SELEX para este RR AbrA2.

AbrC3DBD

Regiones promotoras (SCOs) Función

1376 regulador transcripcional LacI

1801 regulador de respuesta (TCS)

1810 (x2) proteína de membrana (putativa)

1835 proteína de membrana (putativa)

2616 proteína de membrana (putativa)

2782 descarboxilasa piridoxal-dependiente (putativa) 3166 (x9) proteína membrana de transporte

3146 proteína de secreción (putativa)

3936 proteína iniciación de replicación plásmido (putativa) 4148x2 proteína de union ATP (transportador ABC) (putativa)

4597 HK AbrC2 (TCS)

4802/03 proteína hipotética/ proteína hipotética 4822/23 proteína integral de membrana (putativa)/desconocida 6543/44x2 proteína hipotética / proteína de membrana (putativa)

Tabla R.14. Regiones promotoras resultantes de la captura de DNA con el regulador AbrA2DBD. En la columna de los SCOs de las regiones promotoras se muestra entre paréntesis (x N) el número de veces que ese promotor salió representado en el experimento.

3. COMPROBACIÓN DE LAS POSIBLES DIANAS MOLECULARES