Classroom Practice and Assessment for Learning

Actualmente se asume que las características fisiológicas de las células en un cultivo

planctónico que tiene lugar en un reactor a escala de laboratorio, con adecuada transferencia de materia y calor son bastante similares para todos los individuos. Se considera, en particular para esta escala, que cuando se quiere evaluar alguna característica

fenotípica la muestra que se toma es representativa de todo el volumen. A estos fines se centrifugan las células de un cultivo líquido y se trabaja sobre el conjunto como una población relativamente homogénea. Las mayores diferencias entre células en cultivos líquidos se dan en función del tamaño de la escala del reactor. Esta situación no ocurre dentro de un biofilm, donde a nivel de microescala existen marcados gradientes de nutrientes, de productos de desecho y presencia de compuestos señalizadores que varían temporal y espacialmente a lo largo del periodo de formación del biofilm, en estructuras que no superan el tamaño de los 500 µm. Estudiar un biofilm ha impuesto a la microbiología entrar en la micro y nano-escala, poder desarrollar nuevos sistemas de crecimiento y evaluar ese desarrollo sin perturbar el sistema. En este sentido dentro de las muchas medidas que se han realizado para estudiar el comportamiento de los nutrientes en las distintas zonas de los

biofilms, una de las más estudiadas ha sido el nivel de O2. A través de la utilización de micro-

electrodos se han logrado realizar medidas que indican un decrecimiento de la concentración del gas con la profundidad de la estructura. Este comportamiento no es atribuible solamente a una disminución en la difusión, ya que la matriz es un ambiente acuoso en el que el O2 por su tamaño difunde relativamente bien, aunque en un menor

porcentaje que si lo hiciera en agua pura. Lo que afecta la disponibilidad de O2 es que a

medida que el gas difunde va siendo consumido por las bacterias que se encuentran en las capas más superficiales, de modo que la concentración local es un equilibrio dinámico entre la difusión y el consumo. Un proceso similar ocurre con los nutrientes que se encuentran en el seno de la solución. De manera contraria, los productos de desecho se encuentran más concentrados en el interior del biofilm y difunden al medio siguiendo un proceso de difusión en sentido contrario al de los nutrientes. Ambos procesos se ejemplifican en la Figura 8. Una posibilidad diferente sería el comportamiento de los productos que pudieran ser generados dentro del biofilm y también consumidos dentro de él por células de una especie diferente a la productora. Esto llevaría a que exista una concentración máxima dentro del biofilm, y que el producto nunca alcance el seno del líquido (Fig. 8.A) (98, 99).

Es razonable entonces que debido a todas las diferencias nutricionales y ambientales que generan los perfiles de difusión mencionados, se observen respuestas fisiológicas distintivas o que ocurra una adaptación en las células que se encuentran en las diferentes zonas. Un ejemplo que muestra, tal vez drásticamente las variaciones del ambiente al que se encuentran sometidas las bacterias a lo largo del biofilm, es el publicado por investigadores

de la Universidad de Southampton, que utilizando una tinción fluorescente diferencial para bacterias vivas y muertas (LIVE/DEAD), muestran como en un mismo momento del desarrollo, las células que se encuentran en contacto con la superficie (y alejadas del seno del líquido con nutrientes) se encuentran muertas, mientras las que están más próximas a la superficie (en contacto con el medio de cultivo) se encuentran vivas (ver figura 8-B). Otro trabajo muy interesante publicado recientemente por el Dr. Diego Serra analiza, utilizando Microscopía Electrónica de Barrido, las diferencias estructurales de un biofilm

correspondiente a una microcolonia de E. coli K12 crecida sobre agar. Realizando cortes con un criomicrótomo observaron diferentes zonas de la estructura; la zona de base, que es la zona en contacto con los nutrientes, la capa más superficial, con menor concentración de nutrientes y también zonas de los bordes de la microcolonia. Se observaron marcadas diferencias en cuanto a la morfología de las bacterias y a la expresión de filamentos. En la parte inferior se observaron células alargadas, en división activa, embebidas en una red intensa de filamentos que fueron identificados como flagelos. A medida que se fueron analizando zonas más profundas, las estructuras filamentosas dejaban de observarse y lo que mantenía a las células unidas eran fibras de tipo curli, y la morfología de las bacterias se transformaba de alargada a ovalada encontrándose células aisladas en la capa más superficial sostenidas en una matriz estructural de curli. La transición entre un tipo de morfología y el otro resultó ser muy abrupta. Por otro lado al analizar los bordes del biofilm

se observó que la morfología correspondía a una zona muy similar a la zona de la base aunque con presencia de una red flagelar menor. De esta manera se pudo determinar que el ambiente en el cual se encuentran las células condiciona la expresión de los filamentos y la morfología, efecto que posiblemente esté relacionado con el grado de actividad metabólica (100).

A B

El proceso general de crecimiento en biofilm así como también los mecanismos de adaptación microbiana a las diferentes condiciones micro-ambientales que se describieron anteriormente, se encuentran sometidos a una eficiente regulación por parte de las bacterias. Dentro de los sistemas de regulación más ampliamente estudiados se encuentra el sistema de Quorum Sensing. Este sistema de señalización intercelular se basa en la producción de distintos tipos de moléculas derivadas de las acil-homoserin-lactonas en el caso de las bacterias Gram-negativas, y de oligopéptidos en el caso de bacterias Gram- positivas (101, 102). Estas moléculas son liberadas al medio extracelular y permiten sensar la densidad celular. Cuando el número de células es alto, la acumulación de las señales alcanza un valor umbral que desencadena una cascada de señalización y estimula la producción de

biofilm. En el caso de P. aeruginosa se han descrito varios sistemas de QS, el sistema LasR- LasI, que controla la expresión de varios factores de virulencia extracelulares y a su vez también controla al sistema de QS, RhlR-EhlI, que interviene en la regulación de la producción de varios metabolitos secundarios. Otras especies para las que se han reportado

Figura 8-A. Esquema donde se representa las diferentes posibilidades de concentración de nutrientes que provienen del seno del líquido, un desecho metabólico o producido dentro de la estructura en una zona intermedia dentro de un biofilm de geometría semi-esférica. En la Figura 8 B se observa una imagen de fluorescencia realizada con una tinción LIVE/DEAD donde se ve en la zona interna, un cúmulo de bacterias muertas mientras que en la zona más externa las células permanecen vivas. (Imágenes tomadas del sitio de la Universidad de Montana- Centro de Ingeniería del Biofilm: http://www.biofilm.montana.edu/)

50µm Nutriente

Producto de desecho

Producto intermedio

moléculas de homo-serinlactonas son E. coli, V. cholerae, S. typhimurium y Burkohlderia spp.

(101).

Existe otro tipo de reguladores que intervienen en la formación de biofilm y son los denominados reguladores globales. En el caso de P. aeruginosa, la proteína de represión de catabolito (Crc), que está relacionada al metabolismo del carbono, también intervendría en la estimulación de la expresión de fimbrias de tipo IV y de esta manera en la formación de microcolonias (103). Para E. coli se ha descrito la relación del par OmpR (proteína de membrana) y RpoS (regulador maestro) (104, 105). En esta misma especie, el regulador CsrA, que interviene en el metabolismo del carbono, también participa en la activación de la dispersión de los biofilms en varias condiciones de cultivo (106). De la misma manera varios sistemas de dos componentes han sido relacionados a la formación de biofilm tanto en bacterias Gram-positivas como Gram-negativas.

Recientemente se ha descrito un tipo de regulación postranscripcional que estaría asociado a la formación de biofilm en bacterias. Se trata de la regulación que ejerce la concentración de bis-(3'-5')-cyclic dimeric guanosine monophosphate c-di-GMP), un metabolito cuya concentración está regulada por la actividad di-guanilato ciclasa y fosfodiesterasa (107).