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Como mencionamos, los RLRs son helicasas de ARN citosólicas que activan IRF3/7 y NFκB. La familia de los RLRs está compuesta por el Receptor Inducible por Ácido Retinoico (RIG-I), el Gen Asociado a la Diferenciación de Melanoma (MDA5) y Laboratory of Genetics and Phisiology 2 (LGP2). Mientras RIG-I y MDA5 contienen un dominio de helicasa de ARN (caja DExD/H), dos dominios de reclutamiento de caspasas (CARD) N-terminales que activan la vía de señalización por medio de la unión de proteínas adaptadoras que contienen CARD y un dominio C-terminal, LGP2 carece de CARDs (Kawai and Akira 2008; Yu and Levine 2011; Yoneyama et al. 2015) (Figura 1.4).

MAVS/IPS-1 está compuesta de un CARD en el extremo N-terminal, una región central rica en prolina (PRR), la cual contiene dos motivos de unión al Factor Asociado al Receptor del Factor Necrosis Tumoral (TBMs: TBM1 y TBM2), un tercer TBM (TBM3) y un dominio transmembrana (TM), el cual restringe la localización de MAVS específicamente a la mitocondria (Figura 1.4).

RIG-I y MDA5 sensan grupos complementarios de ligandos de ARN viral. RIG-I reconoce preferencialmente ARNdh cortos (<300pb) con extremos truncados y un 5’-trifosfato (5’-ppp) típico de ARNdh genómico de virus, mientras

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Figura 1.4. Estructura de los RLRs.

Representación esquemática de las estructuras de los dominios de los RLRs y de MAVS. Los tres RLRs son Helicasas de ARN cuyo dominio está ubicado en una caja DExD/H y comprende el dominio helicasa 1 (Hel1) y 2 (Hel2), el dominio de inserción de Helicasa (Hel2i), un dominio puente y el dominio C-terminal (CTD). RIG-1 y MDA5, pero no LGP2, tienen un tándem N-terminal de CARDs. MAVS está compuesto de un CARD, una región central rica en prolina (PRR) que contiene 2 sitios de unión a TRAF (TBM1 y TBM2), un tercer TBM (TBM3) y un dominio transmembrana (TM). (Figura adaptada de Yoneyama et al. 2015).

que MDA5 se une a ARNdh largos (>1000pb) sin extremos específicos (Reikine, Nguyen, and Modis 2014).

En ausencia de ARNdh, RIG-I tiene una conformación inactiva cerrada. Al unirse al ARN a través de la helicasa y el dominio C-terminal, se liberan los CARDs, los cuales entonces reclutan y activan el adaptador de señal MAVS. Se produce un ensamblaje de RIG-I en forma de “perlas de un collar” a partir del extremo 5’ppp, proceso que es dependiente de ATP. En contraste, MDA5 tiene sus CARDs en conformación activa y puede ensamblarse cooperativamente desde cualquier ubicación del ARNdh, dando origen a filamentos sensibles a ATP. Los filamentos formados por la interacción de CARDs de MDA5 son los responsables de nuclear el ensamble de MAVS para dar lugar a la formación de esta forma polimérica activa (Yoneyama et al. 2015) (Figura 1.5).

En ambos casos se requiere una conformación de agregados proteicos para que la señalización pueda ser llevada a cabo. La formación del agregado de estos receptores con MAVS es lo que permitirá la interacción de este último con los miembros de la familia TRAF (Yoneyama et al. 2015) (Figura 1.5).

Más recientemente, se ha demostrado que en ciertas infecciones virales se observa la aparición de los denominados agregados proteicos similares a gránulos de estrés (SG) en el citoplasma celular. Se ha demostrado que PKR es

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Figura 1.5. Modelo de reconocimiento de ARN por RIG-I y MDA5, e interacción con MAVS para generar la señal de activación.

Una vez presentado el extremo 5’ppp de un ARNdh corto, RIG-I sufre un cambio conformacional de un estado inactivo a uno activo y oligomeriza sobre el ARNdh desde su extremo. En cambio MDA5 no posee una forma inactiva en ausencia de ligando. MDA5 se une preferencialmente a un sector interno de un ARNdh largo, sin especificidad por los extremos. Se ensambla cooperativamente en un filamento sobre el ARNdh. En ambos casos, la forma oligomérica de los CARDs de los RLRs favorece la interacción con el CARD de MAVS y la formación de oligómeros RLR-MAVS. (Figura adaptada de Yoneyama et al. 2015)

capaz de sensar la entrada de un virus y dar origen a estos gránulos. Pero también se ha descripto que estos gránulos pueden contener también RLRs y varias moléculas con acción antiviral. Se supone que estos gránulos tienen la función de favorecer el reconocimiento del ARNdh viral por los receptores MDA5 y RIG-I (Yoneyama et al. 2015) (Figura 1.5).

La señal entonces es propagada secuencialmente a partir del ligando unido al RLR hacia MAVS y hacia las protein-quinasa citosólicas IKK y TBK1, las cuales activan los factores de transcripción NF-κB e IRF3/7, respectivamente. La interacción entre MAVS e IKK y TBK1 está dada por TRAF3.

A su vez, MAVS también es capaz de interactuar con RIP-1 y FADD, dos proteínas asociadas a la señalización de receptores de muerte. Una vez activados NF-κB e IRF3/7, son translocados al núcleo, donde inducen la expresión de interferones tipo I y otras moléculas proinflamatorias (Figura 1.6).

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Figura 1.6. Vías de señalización de los RLRs.

RIG-I y MDA5 reconocen un grupo complementario de ligandos de ARNdh viral citosólico. Su activación está finamente regulada por fosforilación, ubiquitinación y proteínas como LGP2. RIG-I y MDA5 señalizan por MAVS, el cual inicia la producción de la señalización para la producción de interferones tipo I (Figura adaptada de Reikine et al. 2014).

Un dominio transmembrana liga a MAVS a la membrana mitocondrial o del peroxisoma. La señalización por MAVS es diferente dependiendo de si la unión ocurre en la mitocondria o en el peroxisoma. Unido a peroxisoma induce una rápida expresión independiente de interferón de factores de defensa antiviral, activando ISGs (IFN-stimulated genes), los cuales preceden a la activación de la vía principal dependiente de IFNs por MAVS unido a mitocondria, que amplifica y estabiliza la respuesta antiviral. Además, MAVS unido a la mitocondria sería responsable de la inducción de apoptosis por disrupción del potencial de membrana mitocondrial y la activación de caspasas (Reikine, Nguyen, and Modis 2014; Dixit et al. 2010).

La señal de los RLRs es regulada por numerosos factores del huésped y virales a través de varios mecanismos, incluyendo la degradación de la cadena de poliubiquitina unida a los CARDs y el clivaje de las MAVS por proteasas codificadas por virus. La poliubiquitinación ha sido una de las modificaciones más extensivamente estudiadas de RIG-I y MDA5. La oligomerización de los

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sensores de ARNdh RIG-I y MDA5 que activa la respuesta inmune innata antiviral depende en parte de una cadena de poliubiquitina no anclada, ligada por interacciones no covalentes a una lisina en la posición 63 del dominio CARD. Existen ciertas ligasas y deubiquitinasas que son responsables de la activación e inactivación respectivamente, de la formación de los agregados de proteínas y por tanto, de la señalización posterior (Reikine, Nguyen, and Modis 2014) (Figura 1.6). Además de la ubiquitinación, la fosforilación es un mecanismo regulador importante de la señalización. Tanto RIG-I como MDA5 tienen sitios de fosforilación en sus dominios CARDs que producen la inhibición de la unión a ARNdh. Las enzimas responsables de esta fosforilación son la protein-quinasa C α

y β (PKCα/β). Por otra parte, RIG-I y MDA5 están constitutivamente fosforilados hasta la aparición del ARN viral, en cuyo caso los RLRs deben ser desfosforilados por la Fosfoproteina Fosfatasa 1α y γ (PP1α/γ) para lograr la unión al ligando y la activación (Reikine, Nguyen, and Modis 2014) (Figura 1.6).

Además de las mencionadas modificaciones postraduccionales de los RLRs, la señalización está también modulada por varias proteínas diferentes. Una de ellas es la tercera RLR, LGP2. Dado que carece de CARDs, no es capaz de activar MAVS, sin embargo sí posee capacidad de reconocer ARNdh, lo que permite modular la capacidad de señalización por RIG-I y MDA5. LGP2 inhibe la señalización por RIG-I, debido a que reconoce completamente el mismo ligando viral. En contraste, LGP2 amplifica la señalización por MDA5, por un mecanismo poco claro, pero que parece facilitar el reconocimiento de ARNdh viral por MDA5 a través de interacciones entre el extremo C-terminal de LGP2 y el ARNdh (Reikine, Nguyen, and Modis 2014) (Figura 1.6).