Mixed Methods Research

3.1.5.1 Hidrolizados proteicos preparados por activación de una proteasa endógena En nuestro laboratorio se ha detectado la presencia de una proteasa aspártica endógena en los aislados proteicos de amaranto (Ventureira y col., 2012). La activación de esta proteasa nos permitiría obtener hidrolizados sin adición de enzimas exógenas. Con el fin de encontrar las condiciones para obtener la máxima hidrólisis del aislado por acción de tal enzima, se realizaron ensayos en los que se variaron pH, temperatura y tiempo de incubación.

I. Selección del pH para obtener hidrolizados de amaranto

El aislado proteico se suspendió en agua destilada al 2% p/v y se incubó durante 15 minutos a 37°C en un agitador orbital con termostato a una velocidad de 400rpm. La preparación se dividió en alícuotas a las cuáles se les ajustó el pH con HCl 1,0 N, entre

1,5 y 4,0, con variaciones de 0,5 unidades de pH. Las mezclas de reacción se incubaron durante 3 horas a 40°C con agitación constante. La reacción de hidrólisis se detuvo por calentamiento de la mezcla de reacción a 95°C durante 10 minutos. Las muestras fueron congeladas y almacenadas a -20°C hasta su análisis.

II. Selección de la temperatura de reacción para obtener hidrolizados de amaranto

El aislado proteico se suspendió en agua destilada (2% p/v) y se incubó durante 15 minutos a 37°C en un agitador orbital con termostato a una velocidad de 400rpm. Luego se ajustó el pH con HCl 1,0 N, se separó en alícuotas y se incubaron durante 3 horas a distintas temperaturas: temperatura ambiente (25°C), 40°C, 55°C y 65°C con agitación constante. La reacción de hidrólisis se detuvo por calentamiento de la mezcla de reacción a 95°C durante 10 minutos. Las muestras fueron congeladas y almacenadas a 20°C hasta su análisis.

III. Selección del tiempo de reacción para obtener hidrolizados de amaranto

El aislado proteico se suspendió en agua destilada (2% p/v) y se incubó durante 15 minutos a 37°C en un agitador orbital con termostato a una velocidad de 400rpm. Luego se ajustó el pH con HCl 1,0 N y se separó en alícuotas, las cuáles se incubaron a la misma temperatura durante distintos tiempos: 1, 3, 5, 7 y 16 horas, con agitación constante. La hidrólisis se detuvo por calentamiento de la mezcla de reacción a 95°C durante 10 minutos. Las muestras fueron congeladas y almacenadas a 20°C hasta su análisis.

IV. Obtención del hidrolizado proteico de amaranto

Una vez establecidas las condiciones de pH, temperatura y tiempo de incubación adecuadas para llevar a cabo la hidrólisis enzimática, se procedió a preparar el hidrolizado proteico. Para obtener una masa adecuada de proteínas hidrolizadas se mantuvo la relación sólido:agua destilada (2% p/v) pero se preincubó durante una 1,5 horas a 37°C en un agitador orbital con termostato a una velocidad de 400rpm, a fin de asegurar el equilibrio térmico. Luego se ajustó el pH con HCl 1,0 N y se incubó la mezcla de reacción a la temperatura y tiempo seleccionados manteniendo agitación constante. La reacción de hidrólisis se detuvo por alcalización de la mezcla de reacción llevándola a pH 9 con NaOH 2,0 N. En los ensayos que permitieron establecer las condiciones de

reacción con las que se trabajó finalmente se detuvo la reacción por calentamiento. En estos casos el volumen de las alícuotas permitía que el aumento de la temperatura fuese casi instantáneo, a diferencia de lo que sucede al trabajar con volúmenes mayores, en los que para asegurar la inactivación de la enzima de manera inmediata, se optó por llevar la dispersión a pH alcalino en el cual la proteasa no es activa. Los hidrolizados así preparados fueron posteriormente congelados a -80°C y liofilizados. Los hidrolizados obtenidos se molieron y almacenaron a 4°C en recipientes herméticamente cerrados hasta su utilización.

3.1.5.2 Hidrolizados proteicos preparados por adición de proteasas comerciales: alcalasa y tripsina

Para obtener hidrolizados proteicos, el aislado nativo y las fracciones se dispersaron en agua destilada 1% p/v, ajustando el pH a 10 con NaOH 2,0 N. Las dispersiones obtenidas se mantuvieron en agitación constante durante 1 hora a 37°C en un agitador orbital con termostato. Luego de esta preincubación, se agregó la enzima alcalasa, en una relación 0,08 µl de la enzima comercial por mg de aislado, y se incubó la mezcla de reacción durante 20 minutos a 37°C. La alcalasa utilizada es una proteasa bacteriana proveniente deBacillus licheniformis, marca Sigma (2,4 Unidades Anson/g). Una vez pasado el tiempo estipulado se agregó la enzima tripsina en una relación 0,01 mg enzima comercial por mg de aislado, y la mezcla de reacción se incubó durante 20 minutos más. La tripsina utilizada es una proteasa de tipo III de páncreas bovino, provista por Sigma (0,05 Unidades BTEE/mg sólido). La reacción de hidrólisis se detuvo por calentamiento a 85°C durante 10 minutos en baño de agua. Posteriormente cada preparado se congeló a -80°C y se liofilizó. Los hidrolizados obtenidos se molieron y almacenaron a 4°C en recipientes herméticamente cerrados hasta su utilización.

Se tomaron alícuotas a distintos tiempos de proteólisis con el objetivo de estudiar la cinética de reacción y realizar un seguimiento de la misma. Las muestras fueron congeladas y almacenadas a -20°C hasta su análisis.

3.1.5.3 Hidrolizados proteicos obtenidos por digestión gastrointestinal simulada

El aislado nativo se sometió a digestión gastrointestinal simulada empleando el protocolo Roesler y Rao (2001) con algunas modificaciones. El aislado proteico se suspendió en una solución salina de NaCl 0,03 M, en relación 2,5% p/v de proteína. El pH se ajustó a 2 adicionando HCl 1,0 N. Luego de termostatizar la suspensión proteica durante 30 minutos a 37°C, se agregó pepsina en una relación 0,1 g pepsina/g de proteína y se incubó durante 1 hora a 37°C con agitación de 100rpm en un agitador orbital con termostato. Una vez finalizado el tiempo de reacción con pepsina, se ajustó el pH de la suspensión a 6 con NaOH 1,0 N y se agregó pancreatina en una relación 0,1 g pancreatina/g de proteína. Se incubó durante 1 hora a 37°C y 100rpm en el agitador orbital y finalmente se detuvo la hidrólisis por calentamiento de la mezcla de reacción a 85°C durante 10 minutos en baño de agua.

Se tomaron alícuotas a distintos tiempos de proteólisis con el objetivo de estudiar la cinética de reacción y realizar un seguimiento de la misma. Las muestras fueron congeladas y almacenadas a -20°C hasta su análisis.

Reactivos

Solución de pepsina: Pepsina comercial MP Biomedicals 1:15000 5X unidades NF. Se disolvieron 0,4 g de pepsina 1:15000 en 2,5 ml de solución de HCl 0,1 N y NaCl 0,03 M. La solución se incubó a 37°C durante 30 minutos con agitación antes de utilizarla.

Solución de pancreatina: Pancreatina porcina comercial MP Biomedicals 4X-100 USP unidades/mg. Se solubilizaron 0,1 g de pancreatina en 25 ml de NaHCO3 0,1 N y se incubó 30 minutos a 37°C con agitación antes de utilizarla.