4.5 Effective Questioning
4.5.2 EQ: Ease of Implementation
Como hemos mencionado, varios estudios han demostrado que la administración sistémica (intraperitoneal) de poly (I:C), análogo sintético del ARNdh, induce enteropatía (Garside et al. 1991; R. Zhou, Wei, Sun, Zhang, et al. 2007). Si bien ha sido descripto que el intestino delgado presenta una muy alta expresión de TLR3 y que esto promovería el disparo de las señales inflamatorias, en este modelo no se puede descartar la generación de efectos sistémicos que involucren a células y mediadores de sitios extraintestinales. Por otro lado, la asociación de enteropatía con infecciones entéricas implica la inducción de una respuesta local.
Con el objetivo de evaluar el rol de la respuesta inflamatoria generada por el ligando de receptores de la inmunidad innata (poly (I:C)), desarrollamos una técnica de microcirugía denominada asa ligada mediante la cual se puede administrar en forma controlada una determinada cantidad de este ligando en el lumen del intestino delgado proximal. Para tal fin, se eligieron secciones de intestino a 2 cm del estómago y se ligaron dos sitios para determinar un área cerrada de 2-3 cm de longitud. En la Figura 1.7 se pueden observar dos ejemplos del procedimiento de asa ligada realizado en ratones C57BL/6. Señaladas con flechas se encuentran las ligaduras que permiten aislar el sitio a tratar del resto del intestino.
Una vez finalizada la inyección intraluminal, se procedió a suturar la pared abdominal del ratón y se esperó la recuperación de la anestesia. Pasado distintos
Figura 1.7. Imágenes del procedimiento quirúrgico de asa ligada.
Ratones C57BL/6 fueron estimulados en un asa ligada con PBS o poly (I:C) (30ug/g de ratón) y luego sacrificados a las 12hs para procesar el segmento de intestino encerrado en el asa para estudios posteriores. Las imágenes fueron adquiridas luego de sacrificar a los animales.
CAPÍTULO 1- Resultados
períodos de tiempo según el ensayo a realizar, los animales se sacrificaron y se tomaron muestras del asa ligada para su análisis posterior.
Como un método para evaluar la producción de daño histológico por los distintos estímulos procedimos a realizar medidas morfométricas que nos permitieron comparar el daño ejercido por distintos mediadores. De este modo, se procedió a determinar la altura de las vellosidades y la profundidad de las criptas, para luego calcular el cociente Vellosidad-Cripta (V/C) para cada animal bajo cada uno de los tratamientos (Figura 1.8). El cociente V/C es una de las formas de evaluación más empleada ya que es un buen indicador de daño en la mucosa intestinal.
Nuestra primer inquietud fue contrastar los efectos producidos por poly (I:C) inyectado intraperitonealmente, como había sido previamente descripto (Garside et al. 1991; R. Zhou, Wei, Sun, and Tian 2007; R. Zhou, Wei, Sun, Zhang, et al. 2007) , respecto al método de inoculación en asa ligada
Figura 1.8. Imagen representativa de una sección de intestino delgado proximal teñida con H&E.
Ejemplo de las medidas de altura de vellosidad (barras verdes) y profundidad de cripta (barras rojas) sobre la microfotografía obtenida con una de las secciones.
CAPÍTULO 1-Resultados
72
Figura 1.9. Daño intestinal producido por la administración de poly (I:C) en asa ligada (AL) e intraperitoneal (IP) en ratones C57BL/6.
Análisis morfológicos de intestino delgado de ratones C57BL/6 mediante el uso del Cociente Vellosidad/Cripta (V/C) después de 12hs post-tratamiento. N= 4 ratones por grupo, test t no pareado, ***P<0,001.
propuesto por nosotros. De este modo estimulamos ratones C57BL/6 con poly (I:C) o PBS mediante administración intraperitoneal o intraluminal en asa ligada por 12hs. Luego de sacrificar los animales se obtuvieron muestras de intestino delgado para realizar el análisis morfométrico.
Como se observa claramente en la Figura 1.9 la inducción con poly (I:C) intraperitoneal genera una reducción significativa del cociente V/C cuando se compara con el control de PBS intraperitoneal. Por otro lado cuando se administra poly (I:C) en asa ligada se observa una reducción significativa del cociente V/C comparable con el observado en los ratones tratados intraperitonealmente. Sin embargo, es claro el efecto nocivo del procedimiento, dado que puede observarse que el control de PBS en asa ligada presenta un descenso del cociente V/C significativo cuando se compara con los ratones tratados con PBS intraperitonealmente. Además, si se observa la Figura 1.7, podrá verse el enrojecimiento de las asas por la manipulación propia del procedimiento. Por ello, los siguientes procedimientos estuvieron orientados a determinar otro método de administración luminal de los mediadores que permita reducir el daño inducido por el procedimiento quirúrgico.
Así, desarrollamos un estudio morfológico comparativo entre la administración en asa ligada con poly (I:C) o PBS y la administración intraluminal sin previa ligadura de las asas intestinales. El método utilizado en todos los estudios intraluminales se basó en la microcirugía de los animales, inyectando en
CAPÍTULO 1- Resultados
Figura 1.10. Contraste entre la administración de poly (I:C) en asa ligada (AL) e intraluminal (IL) en ratones C57BL/6.
Análisis morfológicos de intestino delgado de ratones C57BL/6 mediante el uso del Cociente Vellosidad/Cripta (V/C) después de 12hs del tratamiento. N= 4 ratones por grupo, test t no pareado, ***P<0,001.
un punto distante 2 cm del estómago, sobre el primer asa intestinal, procurando evitar la primer porción de duodeno que recibe la mayor concentración de enzimas provenientes de páncreas que podrían degradar el estímulo en estudio.
Como se observa en el análisis comparativo entre los dos tipos de administración, poly (I:C) induce daño de modo similar cuando es administrado en asa ligada y cuando se inyecta intraluminalmente sin ligaduras. Por el contrario, se observa un daño menor cuando la administración de PBS es directamente intraluminal (IL) que cuando los ratones fueron sometidos al procedimiento de asa ligada (AL) (Figura 1.10). Con estos resultados como base, los siguientes estudios fueron realizados utilizando la inyección directa intraluminal de poly (I:C) como así también de los estímulos que serán descriptos posteriormente.