de GAGs GLB1↑ GUSB↑ GNS↑ GALNS↑ PCI↑ (serpin A5) A2M↓ AAT↑ (serpin A1) AT3↑ (serpin C1) uPA PLG↑ ANXA2↓ Plasmina ! EGF↑ ANXA1↓ DISRUPCIÓN MBG (filtración defectuosa) INFLAMACIÓN dnA MAM N -Podocitos -MBG -Endotelio Exosomas
Perfil proteómico exosomal de la orina de pacientes hipertensos tratados con i-SRA
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A pesar de que la fuente principal de PCI es el hígado, su síntesis también se produce en el riñón principalmente por células epiteliales del túbulo proximal (CETP) [218]. PCI es una proteína que promueve la coagulación y la inflamación [219] ya que inhibe al activador del plasminógeno urinario (uPA), una serin proteasa que activa el plasminógeno (PLG), convirtiéndolo en plasmina que disuelve los coágulos de fibrina [170]. El plasminógeno sintetizado en el hígado a menudo se extravasa de los capilares sanguíneos a los tejidos cuando hay la inflamación [220]. En este sentido podemos decir que al aumentar PCI, inhibidor de uPA, hay mayor cantidad de PLG no activo y por lo tanto menor degradación de fibrina. Lo que estaría en consonancia con lo observado en nuestro trabajo, donde se ve un aumento del plasminógeno en exosomas urinarios en condiciones de MAM.
Por otra parte, PLG se puede unir a Anexina A2 (ANXA2) promoviendo su activación de manera eficiente para formar plasmina [221]. En nuestro análisis, encontramos una disminución exosomal de ANXA2 y ANXA1 en pacientes MAM, lo que podría indicar una vez más que la ruta para la degradación de fibrina está poco regulada. Las anexinas son una familia de proteínas de unión a fosfolípidos, dependientes de calcio, que se unen de forma reversible a las membranas en las balsas lipídicas y ejercen efectos anti-inflamatorios [222]– [226]. El descenso de regulación de ambas proteínas exosomales ANXA1 y ANXA2 puede contribuir a agravar la situación pro-inflamatoria en este contexto clínico.
Otras dos proteínas exosomales unidas en el análisis, variaron en pacientes normoalbuminúricos, ambas también participan en la coagulación y en la respuesta inflamatoria. Estas proteínas son, el factor de crecimiento epitelial (EGF) y la α-2 macroglobulina (A2M). EGF se ha encontrado expresado en el riñón y desempeña un papel en la modulación de la dinámica glomerular, del metabolismo renal, del transporte tubular, y del mantenimiento y reparación del epitelio [227]. En nuestro análisis aparece aumentado. A2M por otro lado, es un importante inhibidor de proteasas y de metaloproteinasas (MMP) circulantes en fluidos corporales [228], y que observamos disminuida en los pacientes hipertensos normoalbuminúricos. Estas dos proteínas muestran alteración en una etapa temprana, cuando la albuminuria ni siquiera está presente, lo que pone de manifiesto una respuesta subyacente de desregulación del metabolismo renal. Los resultados encontrados, tanto la disminución de A2M en normoalbuminúricos, seguido por el incremento observado de las enzimas de degradación de GAGs en el estado de la albuminuria, están en consonancia con una remodelación en la membrana basal glomerular (MBG) que implica la actividad patológica de MMP, lo que podría contribuir a la hiperfiltración glomerular, y por lo tanto a la excreción de albuminuria y a la pérdida de la función renal como anteriormente hemos publicado [229].
La α-1 antitripsina (AAT, SERPINA1), otro inhibidor de serin proteasas (heparina- independiente) aparece significativamente aumentada en los exosomas de pacientes albuminúricos de acuerdo a lo que vimos en la orina global en el apartado anterior, donde también obtuvimos AAT diferencial en condición de albuminuria. Igualmente, AAT aparece aumentada en la regulación de la inflamación, en la acumulación de matriz mesangial [230],
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151 [231] y en la protección del tracto urinario contra el ataque de proteasas lo cual podría representar un marcador de estrés de podocitos [232].
Sistema del complemento y respuesta inflamatoria
Un sub-conjunto de proteínas alteradas identificadas en el análisis están relacionadas con el sistema del complemento, como parte de la respuesta inmune. Este sistema tiene tres vías de activación: a través de la vía clásica, a través de la vía alternativa, o por medio de la vía de las lectinas [233], [234]. La vía clásica y de las lectinas permiten la escisión de los componentes C4 (C4a y b) y C2 y por lo tanto permiten la activación de la C3 convertasa. Posteriormente, la escisión de C3 a través de la C3 convertasa permite la formación del complejo de ataque a la membrana (CAM), un disparador pro-inflamatorio [233], [235]. Dado que se encontró disminuida la lectina de unión a manosa (MBL)-asociada a serin proteasa (MASP-2) en exosomas de dnA, mientras que los componentes C3, C4a y C4b se incrementaron en condiciones de la albuminuria, sugerimos en este contexto, una aparición favorecida de las vías alternativa y clásica frente a la vía de las lectinas. Se ha visto que los componentes C3 y C4, aparecen aumentados en inflamación crónica, induciendo a los monocitos a la expresión de factores pro-coagulantes [236]. Se sabe que la hipertensión se describe como un proceso inflamatorio y se ha sugerido que los podocitos participan en la eliminación de inmuno- complejos, algunos de los cuales aparecen unidos a vesículas membranosas glomerulares en la orina [237]. Además, en las nefropatías se produce tráfico de proteínas en exceso provocando una respuesta inflamatoria con aumento local de C3 en el lugar donde se produce la reabsorción de proteínas [238], [239]. Por otro lado, los altos niveles basales de C3 en suero se correlacionan con un mayor riesgo a desarrollar hipertensión, diabetes mellitus o infarto de miocardio [236].
Estrés oxidativo
Curiosamente, en nuestro análisis, se vieron aumentadas tanto C3 como transferrina (TF) en la fracción exosomal de hipertensos con albuminuria, de acuerdo con Tang et al. que mostró C3 aumentada en respuesta a TF en las células epiteliales del túbulo proximal (CETP) [240]. Se ha visto que los radicales libres del hierro en la TF es tóxico para las células epiteliales debido a su acumulación intracelular y al daño peroxidativo después de su reabsorción en el túbulo proximal [240]. Nuestros datos apuntan a una acumulación de TF en el riñón en condiciones de albuminuria, con un potente efecto perjudicial por el exceso de acumulación de hierro. De acuerdo con esta teoría, se ha visto que la depleción de hierro reduce la inflamación renal en diabetes experimental [241]. Por otra parte, la ceruloplasmina (CP) también se encontró aumentada en los pacientes albuminúricos hipertensos. La CP es una glicoproteína antioxidante que contiene cobre cuya función es oxidar el hierro ferroso (tóxico) a férrico (no tóxico). Sin embargo, puede ser pro-oxidante en condiciones de aumento del estrés oxidativo mediante la inducción de la producción de ROS y la oxidación de LDL [242]. Hemos obtenido una correlación de la CP urinaria exosomal con el aumento de la albuminuria tal como hemos observado en un trabajo previo en plasma de pacientes hipertensos que progresaron desarrollando albuminuria bajo la misma condición de i-SRA [243].
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CP también actúa uniéndose a mieloperoxidasa (MPO) inhibiendo su actividad oxidante [171], [244]–[246]. MPO exosomal se encuentra disminuida en la condición de dnA, siguiendo la misma tendencia que la observada para la calprotectina en N y el dnA. La calprotectina es un complejo heterodimérico de dos proteínas intracelulares de unión a calcio, S100A8 (MRP8) y S100A9 (MRP14), con un patrón de localización en el riñón predominantemente glomerular [247], [248]. Ambas proteínas , MPO y calprotectina, se han relacionado con un efecto sinérgico, como co-reguladores en la formación de ROS [249]. Los niveles sanguíneos elevados de proteínas S100 en respuesta a la inflamación han sido ampliamente documentados, y se correlacionan positivamente con el riesgo cardiovascular, la diabetes o incluso la proteinuria [250]–[252]. Diferente al patrón que se ve en plasma, la fracción exosomal reveló una tendencia a la baja en los pacientes hipertensos con incipiente albuminuria o sin ella. Esto podría explicarse atendiendo a los mecanismos de reparación de tejidos. La calprotectina está vinculada a un aumento de los macrófagos M2 polarizados, causando una reparación deletérea del tejido, aumentando el daño renal y manteniendo la inflamación [253]. Este efecto de reparación de tejidos requiere el contacto físico entre los macrófagos M2 y las células epiteliales dañadas del túbulo [254], lo que sugiere que podría estar mediado por exosomas. Nuestros datos están de acuerdo con una reparación de tejidos ineficaz en las primeras etapas del proceso de desarrollo y en el mantenimiento de microalbuminuria. Además, la calprotectina también inhibe MMP, cuyo aumento de actividad aparece en este escenario clínico [229] como hemos dicho anteriormente.
Panel diagnóstico de dnA
Se seleccionaron tres proteínas representativas que muestran niveles alterados en dnA en estos pacientes hipertensos bajo tratamiento con i-SRA. A través de un análisis sobre la base de un ensayo específico por espectrometría de masas SRM, se obtuvo un panel molecular que responde a la condición hipertensiva dnA. Este panel está compuesto por tres marcadores exosomales: antitrombina III (AT3), olfactomedin 4 (OLFM4) y mieloperoxidase (MPO); los dos primeros aparecen aumentados y el último disminuido.
Como hemos dicho anteriormente, la actividad del inhibidor de serin proteasas AT3 es estimulada por la unión al proteoglicano heparán sulfato, el cual se encuentra en la superficie luminal de las células endoteliales [214]. Se sabe que AT3 está relacionado con la homeostasis en el riñón, y sus niveles de concentración en la orina se correlacionan con la excreción de albúmina y de PLG [255], lo que se correlaciona con lo observado. OLFM4 (también conocido como hGC-1, GW112) es también una glicoproteína de matriz extracelular [256], que participa en la diferenciación celular e inflamación [257], [258], y en la regulación de la apoptosis y la proliferación [259]–[261]. En el riñón, OLFM4 se observó en el túbulo, pero no en el glomérulo [174] y se encontró significativamente aumentada en vesículas extracelulares urinarias aisladas en enfermedad renal poliquística [262]. Con tendencia opuesta, se encontró MPO disminuida en los exosomas de pacientes con dnA. MPO es una proteína con grupo hemo catalizadora de la oxidación de las lipoproteínas, en el riñón aparece expresada en las membranas basales glomerulares y en infiltrados de células mononucleares
Discusión
153 [245]. Una deficiencia en la expresión de MPO se ha visto que se corrobora con una alta incidencia de diabetes mellitus y de enfermedades trombóticas, así como un aumento de la concentración sérica de fibrinógeno; lo que indica la importancia de la relación entre células circulantes y coagulación de la sangre [245].
En conclusión, en nuestro estudio, los resultados obtenidos sugieren un papel importante del sistema inmune durante la hipertensión, en particular, en la respuesta inflamatoria. Esto se refleja claramente en las proteínas exosomales de la orina, como reservorios de proteínas alteradas durante la patogénesis. Estudiando este subproteoma, vemos un vínculo funcional entre las proteínas relacionadas con la coagulación, el sistema de complemento y el estrés oxidativo y por otro lado creamos un panel de diagnóstico de desarrollo de albuminuria incipiente. Esta es una demostración más de que la proteómica cuantitativa de vesículas extracelulares urinarias es una poderosa herramienta para monitorizar proteínas que de otro modo sería difícil al no poder acceder de forma no invasiva en el riñón. Además, nuestros resultados permiten avanzar en la comprensión de la fisiología del tracto urinario y de la patología de la albuminuria en hipertensos no diabéticos.
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