3.1 Recolección de muestras
El registro de variables y la recolección a campo de muestras de agua en los 12 sitios previstos y en las 9 fechas de muestreo consistió en:
1) medición de parámetros fisicoquímicos: se registraron in situ temperatura, oxígeno disuelto, salinidad, pH, conductividad y turbidez utilizando una sonda multiparamétrica HORIBA U-10®.
2) recolección de muestras de agua: directamente del curso de agua o con la ayuda de un balde plástico. En los puntos de desembocadura, la muestra se tomó durante marea baja a fin de recolectar la muestra lo más cruda posible y evitar su mezcla con el cuerpo de agua receptor (agua de la costa). Estas muestras se recolectaron para determinar posteriormente en laboratorio los siguientes parámetros: nutrientes inorgánicos disueltos (NID), materia orgánica particulada (MOP), sólidos totales en suspensión (STS) y bacterias coliformes totales y fecales (CT y CF).
Las muestras destinadas a la determinación de NID, MOP y STS se recolectaron en botellas plásticas PET de 2.25 L acondicionadas para tal fin y en todos los casos se siguió el mismo procedimiento: enjuague de la botella con agua del lugar, posterior descarte y recolección final, completando la botella hasta el ras y cerrándola herméticamente. Las muestras destinadas a la determinación de CT y CF se recolectaron en envases plásticos estériles de 125 mL tomando las precauciones necesarias para evitar su contaminación.
Ambas muestras se mantuvieron en heladera plástica de campo hasta llegar al laboratorio. Todo el proceso de manipulación de muestras de agua siguió las normas internacionales de la USEPA descriptas en los manuales de estudio de efluentes (USEPA, 2002a; 2002b).
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3.2 Procesamiento de las muestras en laboratorio
Una vez en el laboratorio, las muestras se mantuvieron a 8ºC y en oscuridad hasta su procesamiento, a fin de retardar la acción biológica y posible hidrólisis de compuestos y complejos químicos.
El procesamiento para determinar NID y MOP se realizó dentro de las 2 horas posteriores a la recolección de muestras y finalizó el mismo día. Para determinar STS se permitió un tiempo máximo de procesamiento de 72 horas. En el caso de la determinación de CT y CF, el cultivo comenzó inmediatamente después de la recolección y no se extendió por más de 2 horas desde el momento de muestreo.
Determinación de Nutrientes Inorgánicos Disueltos (nitratos, nitritos, amonio, fosfatos y silicatos)
Las muestras para determinar NID se filtraron utilizando un equipo de filtración y una bomba de vacío, a través de un filtro de fibra de vidrio de 1.2 μm de poro y 47 mm de diámetro (Whatman GF/C) previamente calcinado (dentro de un sobre de papel aluminio a 450-500ºC, de acuerdo a Strickland & Parsons (1972)).
Para la determinación de nitratos (NO3-), nitritos (NO2-), fosfatos (PO43-) y silicatos (SiO33-), la muestra filtrada se distribuyó en envases de plástico de 30 mL de capacidad
previamente acondicionados con HCl y se preservaron a -20ºC hasta el momento de su análisis (APHA-AWWA-WEF 1998). La concentración de estos nutrientes se determinó utilizando kits de reactivos colorimétricos WTW, cuya metodología está validada y es análoga a la metodología utilizada internacionalmente (DIN/ISO/EN/USEPA). Los protocolos de las técnicas para la determinación de nutrientes están desarrollados en el ANEXO I (página 214).
Para la determinación de amonio (NH4+), la muestra filtrada (ya sea cruda o diluida,
según el caso) se preservó por duplicado en frascos de vidrio color ámbar previamente acondicionados. Se fijó la muestra con 1 mL de solución de fenol (fenol cristalino en alcohol etílico) y se conservó a 4°C y oscuridad hasta su determinación como máximo dentro de los 10 días. Los fundamentos de la determinación de amonio por la técnica del indofenol (Strickland & Parsons, 1972) están desarrollados en el ANEXO I (página 214).
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Determinación de Materia Orgánica Particulada
Las muestras destinadas a la determinación de MOP se filtraron de la misma manera que para la determinación de NID. En este caso, luego del filtrado se agregaron 4 mL de Na2SO4 anhidro al filtro con el material retenido para eliminar cloruros. El filtro de fibra de vidrio fue plegado en 4 y se conservó en sobre de papel aluminio a -20°C hasta su análisis. La concentración de MOP en el agua se obtuvo mediante el método de oxidación húmeda de Strickland & Parsons (1972) y su fundamentación está desarrollada en el ANEXO I (página 214).
Determinación de Sólidos Totales en Suspensión
Para determinar la cantidad de STS presentes en la muestra, se filtró por duplicado un volumen conocido de agua (entre 50 y 500 mL, según el sitio) utilizando filtros de membrana de acetato de celulosa Millipore de 0.45 μm de poro y 47 mm de diámetro. La concentración de STS se calculó como la diferencia absoluta entre el peso seco del filtro vacío y el peso seco del filtro con muestra, corregida por el volumen filtrado. El fundamento y el protocolo de esta técnica se encuentran desarrollados en el ANEXO I (página 214).
Determinación de Bacterias Coliformes totales y fecales
La detección y cuantificación de CT y CF se realizó mediante la técnica de fermentación de tubos múltiples ó número más probable (NMP). Se utilizó el test de reactivos COLITAGTM (CPI International) cuyo procedimiento análogo al 9221C y E (APHA- AWWA-WEF, 1998) está aprobado por la USEPA para la detección de bacterias indicadoras de contaminación fecal en agua potable, naturales y residuales.
El procedimiento consta de la incubación de la muestra de agua (cruda o diluida, según el caso) con el medio de cultivo selectivo ColitagTM durante 24 horas en estufa (las primeras 4 horas a 35 ± 0.5ºC y posteriormente a 44.5 ± 0.2ºC). Finalizado este período, se observa la existencia de coloración amarilla en la muestra (lo que indica la presencia de CT) y una fluorescencia azul bajo lámpara que emite luz ultravioleta (lo que indica la presencia de bacterias Escherichia coli). Finalmente, se cuantifica de acuerdo a los valores obtenidos en la tabla del NMP. El protocolo detallado y la fundamentación de esta técnica están desarrollados en el ANEXO I (página 214).
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3.3 Acondicionamiento previo del material utilizado
Para el acondicionamiento de todo el material utilizado se siguieron los protocolos establecidos por Strickland & Parsons (1972), APHA-AWWA-WEF (1998) y USEPA (2002a).
El material utilizado para la recolección de muestras se lavó con detergente no iónico diluido, se enjuagó repetidas veces con agua corriente, luego con agua destilada y finalmente se sumergió en HCl al 5% (v/v) por 24 horas. Al día siguiente se enjuagó varias veces con agua destilada y se secó en estufa a 35-40ºC.
Los frascos plásticos y los tubos de ensayos utilizados en la conservación y determinación de NID (NO3-;NO2-; PO43- y SiO33-) se sumergieron en HCl 5% por 24 horas. Posteriormente se enjuagaron varias veces con agua destilada y se secaron en estufa a 35- 40ºC.
Los frascos de vidrio color ámbar utilizados en la determinación de amonio se mantuvieron con solución sulfonítrica por 24 horas, luego se enjuagaron intensamente con agua destilada y se secaron en estufa. Posteriormente se sumergieron en HCl 5% por 24 horas, luego se lavaron con agua destilada y se secaron en estufa a 35-40ºC. Una vez secos, se cerraron con papel aluminio previamente a la tapa plástica para evitar la contaminación con amonio atmosférico (Strickland & Parsons, 1972).
El material utilizado en la determinación de MOP (probetas y tubos de ensayo) se dejó por 24 horas en solución sulfonítrica, luego se enjuagó con agua destilada y se secó en estufa. Posteriormente se sumergió en HCl 5% por 24 horas, se lavó con agua destilada y se secó en estufa a 35-40ºC.
El material empleado para la detección y cuantificación de CT y CF (tubos de ensayo, pipetas, tips, recipientes, varillas de vidrio, entre otros) se esterilizó mediante autoclavado a 121ºC durante 15-20 minutos. Luego se preservaron en un lugar seco y protegido.
Nota: En el acondicionamiento del material para determinar amonio y MOP se utilizó la combinación solución sulfonítrica + HCl en lugar de solución sulfocrómica debido a la menor peligrosidad en la manipulación que presenta la primera.
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