0.4 Why Emotion Recognition Is Not Simulational
0.4.5 Conclusion and Simulationist Response
Los resultados de la secuenciación fueron analizaron en el laboratorio por el Dr. Uciel Chorostecky. El análisis preliminar de los datos, mediante la herramienta FASTQC, indicó que la calidad de las bibliotecas generadas era buena, por lo que se procedió a determinar el número de secuencias que mapean contra el genoma de Arabidopsis y, por último, se obtuvieron los valores de expresión génica diferencial según se indica en Materiales y Métodos.
Inicialmente, se identificaron los genes cuya expresión cambió significativamente en an3 x AN3-GR-GFPó en35S:miR396xrGRF3-GR-GFPtras el tratamiento con dex. Se consideraron cambios de al menos un 25% en el nivel de expresión y un FDR <0,05. Encontramos 378 genes inducidos por AN3y 364 porGRF3. Además, 378 genes fueron reprimidos luego de la inducción deAN3y 334 por la inducción de GRF3 (Figura R3.6A; Anexo Tablas A4-A5). Hallamos un 40% de solapamiento entre ambos sistemas tanto para los genes activados como reprimidos (Figura R3.6B, C), resultado que soporta la noción de que las dos proteínas funcionan como un complejo que regula la transcripción de un conjunto de genes. Cabe destacar, que a pesar de que la construcciones inducibles fueron introducidas en diferentes ecotipos (S96 y Col-0), la cantidad de genes que resultan co-regulados muestra la robustez de la interacción GRF/GIF. Los genes que no aparecen en esta intersección pueden dar cuenta de las funciones que los GIFs y los GRFs desempeñan de manera independiente.
Figura R3.6. Resultados globales de los experimentos de Transcriptómica. (A)Número de genes con cambios de expresión significativos en an3xAN3-GR-GFPy35S:miR396 xrGRF3-GR-GFPtras el tratamiento con dex.(B)y(C)Diagrama que muestra el número de genes reprimidos(A)e inducidos(B)que cambian su expresión de manera significativa en las plantas an3 x AN3-GR-GFPy en35S:miR396 x rGRF3-GR-GFP.
En capítulos anteriores de esta tesis, describimos la función de losGRFsactuando junto con los GIFs para reprimir la expresión de genes específicos de SCN en las células en activa proliferación celular. Sobre la base de estos resultados, decidimos comenzar el análisis de los datos del RNAseq en búsqueda de genes que respondan a esta función. Como las versiones inducibles AN3-GR-GFP y rGRF3-GR-GFP fueron introducidas en plantas an3 y 35S:miR396 respectivamente, era de esperar que los genes de SCN se vieran reprimidos luego del tratamiento con dex en una proporción significativamente más fuerte de lo que sucedería con esos sistemas inducibles en el contexto de una planta silvestre. Al evaluar la lista de genes reprimidos porAN3yGRF3en búsqueda de genes que se expresan en el SCN (Tabla R3.1) (120), encontramos de manera esperable aPLT1. En la lista también aparece GLV6/RGF8, un gen que codifica para un pequeño péptido regulatorio que pertenece a la familia de péptidosGOLVEN/ROOT GROWTH FACTOR/CLE-Like (GLV/RGF/CLEL), que se ha visto que es requerida para el mantenimiento del SCN y la proliferación celular en las TACS (82).
AGI Anotación
AT1G62500 Bifunctional inhibitor/lipid-transfer protein/seed storage 2S albumin superfamily protein AT2G03830 GLV6,RGF8
AT1G12860 ICE2,SCRM2,basic helix-loop-helix (bHLH) DNA-binding superfamily protein AT3G53450 LOG4,Putative lysine decarboxylase family protein
AT1G35610 Cysteine/Histidine-rich C1 domain family protein AT3G22120 CWLP,cell wall-plasma membrane linker protein AT3G50190 Plant protein of unknown function (DUF247) AT2G29330 TRI,tropinone reductase
AT2G32440 ATKAO2,CYP88A4,KAO2,ent-kaurenoic acid hydroxylase 2 AT3G20840 PLT1,Integrase-type DNA-binding superfamily protein AT3G26120 TEL1,terminal EAR1-like 1
AT4G39950 CYP79B2,cytochrome P450, family 79, subfamily B, polypeptide 2 AT5G56790 Protein kinase superfamily protein
AT3G50620 P-loop containing nucleoside triphosphate hydrolases superfamily protein AT5G25900 ATKO1,CYP701A3,GA3,GA requiring 3
Tabla R3.1. Genes que se expresan en SCN y son reprimidos por AN3 y GRF3.
De la familia de genesPLTsreprimidos porAN3yGRF3, encontramos además dePLT1aPLT2. Los otros miembros de la familia,PLT3yBBM, no resultaron afectados tal como se había visto en los datos de transcriptómica de puntas de raíces 35S:miR396 (Figura R1.15C). Teniendo en cuenta que los cambios de expresión detectados paraPLT1yPLT2se producen luego de una breve inducción de dos horas en ambas líneas, podríamos pensar en una regulación de tipo directa del sistema GRF/GIF sobrePLT1yPLT2, mientras que paraPLT3yBBM, podríamos pensar en una regulación indirecta que ocurre probablemente a tiempos mayores de inducción o en líneas estables sobreexpresantes del miR396.
Además de GLV6, se vieron reprimidos GLV3 y GLV9, pertenecientes a la misma familia de péptidos de señalización que GLV6. Aparecen también genes como SBT1.3 (AT5G51750) y RGI5 (AT1G34110) que codifican para una enzima involucrada en la maduración del péptido y para uno de sus receptores, respectivamente. Estos resultados nos indicaron que el complejo GRF/GIF afecta de manera global la vía de señalización de losGLV.
A continuación, nos enfocamos en los genes regulados positivamente por el sistema GRF/GIF. Considerando la extensa caracterización de este sistema como estimulador de la proliferación, era de esperar que la mayoría de los genes regulados positivamente se encontraran involucrados en el control de la progresión del ciclo celular, por lo que decidimos en primer lugar analizar la intersección de la lista de genes regulados positivamente por ambos sistemas inducibles con una lista de genes específicos de mitosis (MSG del inglés "Mitosis Specific Genes") (108). Llamativamente ninguno de los MSG se encontraba inducido por el complejo GRF/GIF. Resultados similares fueron encontrados cuando se analizaron datos de transcriptómica en muestras de ápice de vástagos de plantasrGRF3y
35S:AN3 (Tesis Dr. Juan Manuel Debernardi). En el capítulo 1 de esta Tesis, vimos que estos genes aparecen regulados negativamente en las muestras de puntas de raíz de plantas 35S:miR396, sugiriendo que el efecto de los GRF y GIF sobre la expresión de los genes involucrados en el ciclo celular puede ser indirecta.
Decidimos a continuación explorar la lista de genes inducidos en búsqueda de categorías de Ontología Génica enriquecidas. Al analizar la lista, encontramos un enriquecimiento significativo en numerosas categorías (Anexo Tabla 6), particularmente fue interesante la aparición de categorías relacionadas con regulación de procesos biológicos, dentro de la cual se encuentran los procesos de desarrollo y metabólicos, como así también en aquellas que indican la participación del complejo en la regulación de la expresión génica (Tabla R3.2).
Descriptor Descripción p-value
GO:0065007 biological regulation 1.30E-07
GO:0009987 cellular process 3.80E-05
GO:0050789 regulation of biological process 1.80E-06
GO:0032502 developmental process 0.0018
GO:0048856 anatomical structure development 0.0028
GO:0048731 system development 0.00073
GO:0048513 organ development 0.00073
GO:0022621 shoot system development 0.0011
GO:0048367 shoot development 0.0011
GO:0048366 leaf development 0.0022
GO:0010468 regulation of gene expression 0.0019
GO:0006350 transcription 0.0028
GO:0032774 RNA biosynthetic process 0.0028
GO:0051252 regulation of RNA metabolic process 0.00082
GO:0006351 transcription, DNA-dependent 0.0028
GO:0045449 regulation of transcription 0.00076
GO:0006355 regulation of transcription, DNA-dependent 0.00075
GO:0008152 metabolic process 0.00017
GO:0019222 regulation of metabolic process 1.60E-05
GO:0044238 primary metabolic process 0.0022
GO:0080090 regulation of primary metabolic process 0.0001
GO:0044237 cellular metabolic process 0.00021
GO:0006091 generation of precursor metabolites and energy 0.00035 GO:0060255 regulation of macromolecule metabolic process 0.00036
Tabla R3.2. Categorías de Ontología Génica relacionadas con la regulación de la expresión génica y procesos de desarrollo enriquecidas en la tabla de genes inducidos por AN3 y GRF3.
Tomados en conjunto, el análisis de las categorías de ontología génica enriquecidas sugieren un rol para AN3 y GRF3 en la regulación de procesos generales que mantienen una alta tasa metabólica en células que se dividen activamente.
El análisis de la lista de los genes inducidos reveló la inducción de dosGRFs, elGRF5y elGRF6. Incluso si se considera un cambio de expresión ligeramente menor al 25% GRF3también resultaría inducido por ambos sistemas. En trabajos anteriores se ha visto que la inducción de AN3 en las primeras hojas en desarrollo conduce a un aumento en la expresión de GRF3, GRF5 y GRF6 entre otros (32). Además existe evidencia de que AN3 interacciona en forma directa con GRF3 y GRF5 derivada de experimentos de doble híbrido y co-inmunoprecipitación (25, 32). Considerando estos resultados, podríamos sugerir que no sólo en parte aérea sino también en raíces los complejos AN3/GRF estarían activando su propia transcripción.