Fear and the Amygdala

Trabajos previos han mostrado que los genes de la familia GIFs actúan de manera redundante como reguladores positivos de la proliferación celular afectando el crecimiento y el desarrollo de los órganos en plantas (56). Particularmente, se ha visto que las mutantes múltiples presentan fuertes defectos del desarrollo del SAM y los órganos florales, poniendo en evidencia nuevas funciones de los genesGIFsque no habían sido previamente descriptas.

Para describir la participación de los cofactores de la familia GIFs (Figura R2.1A) en el desarrollo de la raíz, comenzamos caracterizando su crecimiento en las mutantes simples an3,gif2, gif3(Figura R2.1B). Encontramos que en la mutantean3las raíces eran más largas en comparación a la planta silvestre (Figura R2.1B-D). Este resultado fue inesperado ya que las mutantesan3presentan un SAM más pequeño y una reducción del área de las hojas en comparación con la planta silvestre. No encontramos ningún efecto evidente en el largo de la raíz de las mutantes simples de los otros miembros de la familia,gif2ygif3(Figura R2.1B, C).

Considerando la redundancia en función de los genesGIFsprocedimos con la caracterización de las mutantes múltiples. Al igual que lo visto para el desarrollo de órganos laterales (56), la combinación de mutantesgif2 gif3no presentó diferencias apreciables respecto a la planta silvestre (Figura R2.1B, C), mientras que la doble mutante an3 gif3presentó raíces más largas, que incluso superaron en longitud a las raíces de la simple mutantean3(Figura R2.1B, C). Curiosamente, la doble mutante an3 gif2 exhibió raíces ligeramente más cortas que la planta silvestre, (Figura R2.1B, C), fenotipo que resultó ser más fuerte al analizar la triple mutantean3 gif2 gif3(Figura R2.1B-D).

Figura R2.1.Desarrollo radicular de las diferentes mutantes de los genes de la familiaGIFs. (A)Comparación esquemática de la estructura de los dominios SNH y QG de los diferentes miembros de la familiaGIFde Arabidopsis.(B)Fenotipo de crecimiento de la raíz 15 DPS de plantas silvestres (Col-0),an3,gif2, gif3, gif2 gif3, an3 gif2yan3 gif2 gif3. Barra de escala = 1 cm.(C)Velocidad de elongación primaria para la planta silvestre y las mutantes simples y múltiples de los diferentes miembros de la familia GIF. Se graficaron los valores promedios ± EE de 15 réplicas biológicas. El asterisco indica una diferencia significativa respecto a las raíces de plantas silvestres determinada a través de la prueba T- Student (P <0,05).(D) Evaluación del largo de raíz primaria en función DPS en plantas control (Col-0), la mutante simplean3y la triple mutante an3 gif2 gif3.

Con el objetivo de explicar las diferencias en el fenotipo de velocidad de elongación de raíz primaria, decidimos evaluar en detalle la estructura celular de las diferentes mutantes simples y múltiples. En primer lugar, nos enfocamos en el estudio de la zona meristemática, y encontramos que las mutantes que no presentaron diferencias de crecimiento de raíz primaria con respecto a la planta silvestre tampoco exhibieron cambios significativos en el largo del meristema (Figura R2.2A, B). Sin embargo el resto de las mutantes, independientemente de que se trate de mutantes con raíces más largas o más cortas en comparación con la planta silvestre, presentaron zonas meristemáticas más largas (Figura R2.2A, B). Incluso se observó un efecto aditivo, ya que las dobles mutantes an3 gif3, an3 gif2 y la triple mutante an3 gif2 gif3 presentaron un meristema significativamente más largo que la simple mutantean3(Figura R2.2A, B), resultado que indica que existe redundancia de función entre los genes de esta familia.

Los fenotipos de zona meristemática dean3yan3 gif3se correlacionaban con el aumento del crecimiento de su raíz, sin embargo no fue así para las mutantes an3 gif2 y an3 gif2 gif3.

Considerando que el tamaño final de la raíz no sólo se encuentra determinado por el tamaño de la zona meristemática sino también por la magnitud de la elongación celular, evaluamos el tamaño de las células en la zona madura. En este caso encontramos, que en forma consistente con el largo de raíz primaria, las mutantesan3yan3 gif3presentaron células en la zona madura de mayor longitud en comparación con la planta silvestre (Figura R2.2C, D), sin embargo las mutantes múltiplesan3 gif2 yan3 gif2 gif3exhibieron células maduras más cortas en comparación con las plantas control (Figura R2.2C, D). Las mutantes gif2, gif3 y gif2 gif3 no exhibieron defectos evidentes en las células diferenciadas respecto a las plantas silvestres.

Tomando en conjunto estos resultados, podemos decir que las raíces de las mutantes an3y an3 gif3 son más largas que las raíces de las plantas silvestres como consecuencia tanto de un aumento del tamaño de la zona meristemática como de una mayor elongación de las células en la zona madura, sin embargo el fenotipo de las plantasan3 gif2yan3 gif2 gif3es debido mayormente a defectos de elongación celular.

Figura R2.2. Los genes GIFs participan en la regulación del desarrollo radicular. (A)Arquitectura de la punta de la raíz siete DPS en las plantas control (Col-0),an3,gif2, gif3, gif2 gif3, an3 gif2yan3 gif2 gif3. Las puntas de flecha blancas marcan la posición del CQ, mientras que las puntas de flechas amarillas marcan el final del meristema (ZM) donde las células comienzan a alargarse.(B)Evaluación del largo de la zona meristemática en plantas silvestres y mutantes. Se graficaron los valores promedios ± EE de 15 réplicas biológicas.(C)Células maduras de la corteza en plantas silvestres y mutantes simples y múltiples de los genes de la familiaGIFsiete DPS.(D)Largo de las células maduras de la corteza de plantas silvestres y mutantes. Se midieron al menos 5 células de la corteza en la zona madura por cada raíz. Se graficaron los valores promedios ± EE de75 réplicas biológicas. Tanto en(B)como en(D)letras diferentes indican diferencias significativas determinadas por ANOVA seguido de la prueba de Comparaciones Múltiples de Tukey (P <0,05). Barra de escala = 50µm.

Es claro entonces que los genes GIFs participan en la regulación del desarrollo de la raíz teniendo impacto en las diferentes zonas a lo largo del eje longitudinal del órgano. En la zona meristemática y en la zona de maduración, la contribución de cada mutación a los fenotipos

observados implica un mayor protagonismo de AN3 y luego de GIF2 y GIF3. Esta contribución diferencial a los fenotipos observados puede relacionarse directamente con los niveles de expresión que presentan losGIFs, ya que se sabe que si bien los miembros de esta familia presentan patrones de expresión comparables, AN3 es el miembro que se expresa de manera más abundante en comparación con GIF2yGIF3(56). Para poder estudiar los patrones de expresión de estos genes en raíces preparamos fusiones traduccionales de los tres genes GIFs, que consisten en la fusión de la GFP al extremo C-terminal de la secuencia genómica completa, incluyendo intrones de AN3,GIF2y GIF3 (AN3-GFP, GIF2-GFP y GIF3-GFP) (Figura R2.3A), bajo el control de sus propias secuencias promotoras. Con estos reporteros GFP, pudimos corroborar queAN3yGIF2se expresan en mayores niveles en comparación con GIF3. Además, los patrones de expresión de los tres genes indican que los mismos se expresan mayormente en el meristema y en niveles más bajos en la zona de maduración (Figura R2.3).

Figura R2.3. Patrones de expresión de losGIFs.Expresión de reporteros deAN3, GIF2yGIF3fusionados a GFP. Las puntas de flecha blancas marcan la posición del CQ, las puntas de flechas amarillas marcan el final del meristema (ZM) donde las células comienzan a alargarse y las puntas de flecha verde marcan el final de la zona de elongación (ZE). Barra de escala = 50µm.

7.2.2. Las mutantesgifpresentan una expansión del carácter de SC en el meristema

radicular.

Una inspección más detallada de las raícesan3reveló que tienen un aumento en el número de capas de LRC (Figura R2.4A, B). Cruzas dean3con el reportero de LRC,SMB-GFP(115) confirmaron el aumento en el número de capas de este tejido (Figura R2.4B). Como se describió en el capítulo

anterior, este incremento sugiere una expansión del carácter de SC a la zona de las TACs. Por esto, determinamos por RT-qPCR los niveles de transcripto de varios marcadores de SC. Observamos que los niveles de expresión de PLT1, PLT2, BABYBOOM (BBM), SCR y CYCD6;1 se encontraban significativamente aumentados enan3con respecto a las raíces de tipo silvestre (Figura R2.4C).

A continuación analizamos el número de LRC en las múltiples mutantes para los genesGIFsy encontramos que tanto en el caso de an3 gif2 como dean3 gif2 gif3el aumento de capas de LRC resultó incluso mayor que en la mutante simple an3 (Figura R2.4A). Esa diferencia podría estar relacionada con la función redundante de estos genes controlando el desarrollo del meristema y hablaría nuevamente de un efecto aditivo sobre el grado de expansión de la actividad de las SC en las TACs. Profundizamos estos estudios utilizando reporteros de varios tipos celulares en la doble mutante an3 gif2. La utilización de marcadores de LRC (SMB-GFP) (Figura R2.4D), de células epidérmicas que no generan pelos radiculares (pGL2: H2B-YFP) (Figura R2.4E), de células de la corteza (pCO: H2B-YFP) (Figura R2.4F) y de células de la endodermis (pEND7:H2B-YFP) (Figura R2.4G,H) reveló la aparición de divisiones celulares periclinales generativas ectópicas a lo largo de todo el meristema. No sólo se verificó el aumento en el número de capas de LRC, sino que también se encontraron capas celulares adicionales en todo el meristema. Observamos capas adicionales de epidermis (Figura R2.4E) en cuatro de cada diez plantas, de la corteza (Figura R2.4F) en tres de cada diez y de endodermis (Figura R2.4G, H) en cinco de cada diez.

Además, siendo que los reporteros tejido específico utilizados presentan la proteína fluorescente YFP fusionada a la histona H2B, esta construcción permite evaluar la disposición espacial de los cuerpos mitóticos, que ayuda a distinguir la orientación de las divisiones en curso. En la zona de activa proliferación celular de una planta silvestre, las células presentan figuras mitóticas que se disponen de forma perpendicular al eje longitudinal de la raíz, las cuales son características de células que se dividen anticlinalmente (Figura R2.4H). Sin embargo, en la misma zona, las dobles mutantes presentan con cierta frecuencia células con cuerpos mitóticos dispuestos de manera paralela al eje longitudinal (Figura R2.4H), asociados a divisiones periclinales generativas ectópicas que podrían explicar la aparición de capas extra de tejido.

Figura R2.4. LosGIFsreprimen la actividad de las SC en las TACs. (A)Número de capas de LRC (#LRC) medidos a 50µm hacia arriba del CQ de plantas silvestres (Col-0),an3,an3 gif3, an3 gif2 y an3 gif2 gif3.Se contaron las capas de LRC en al menos diez plantas. Se graficaron los valores promedios ± EE de diez réplicas biológicas. Letras diferentes indican diferencias significativas determinadas por ANOVA seguido de la prueba de Comparaciones Múltiples de Tukey (P <0,05). (B)Expresión de un marcador de específico de LRC (SMB-GFP) en raíces de plantas silvestres (Col-0) yan3. Se observa ampliada la misma región en las diferentes raíces para mostrar en detalle el aumento de LRC.(C)Expresión relativa deAN3 y una selección de genes específicos de SC en puntas de raíces de plantas control y an3estimados por RT-qPCR. Se graficaron los valores promedios ± EE de tres réplicas biológicas. Los asteriscos indican una diferencia significativa respecto a las raíces de plantas silvestres determinada a través de la prueba T- Student (P <0,05).(D),(E),(F)y(G)Patrón radial de diferentes tejidos en la doble mutantean3 gif2analizado mediante la expresión de reporteros tejido específico: de LRC (lrc) (D), de células epidérmicas que no darán pelo radicular(Ep) (E), de células de la corteza (Co) (F) y de células de la endodermis (En)(G). Se resalta la aparición de las capas adicionales de células en la doble mutantean3 gif2. Las puntas de flecha blancas indican las capas de células adicionales que se encuentran enan3 gif2para el tipo de célula en particular.(H) Detalle de la orientación de una división celular periclinal generativa en el meristema de la mutantean3 gif2que explicaría la capa de endodermis extra. La dirección de la división se infiere de la disposición espacial de la figura mitótica evidenciada por el reportero utilizado. Los recuadros de mayor magnificación muestran figuras mitóticas correspondientes a una división anticlinal en la planta silvestre y periclinal en la doble mutante. Barra de escala = 50µm.