Simulation and Utterance Interpretation

El patrón de expresión de AN3 puede describirse como un gradiente, donde el máximo de expresión se encuentra en el CQ y las SC y luego cae gradualmente a lo largo del meristema, siendo detectable inclusive en la zona madura (Figura R2.3). El GRF3 se expresa en la zona de activa proliferación celular, por encima del SCN, donde sería capaz de interactuar con AN3 para formar un complejo. Como hemos descripto en los capítulos anteriores la actividad de este complejo es necesaria para regular la expresión de numerosos genes que contribuyen a definir los límites de las diferentes zonas de desarrollo a lo largo del eje longitudinal de la raíz.

Como la formación del complejo AN3/GRF3 se da gracias a la superposición de los gradientes de expresión de ambas proteínas, nos preguntamos si sus genes blanco se expresaban en zonas específicas de la raíz. En primer lugar, mapeamos el patrón de expresión de los genes regulados por AN3 y GRF3 haciendo uso de la base de datos RootMap (104). Esto nos permite obtener una perspectiva de la expresión de estos genes a lo largo del eje longitudinal de la raíz. A continuación, considerando los picos máximos de expresión de cada uno de los genes, pudimos clasificarlos en diferentes grupos (Figura R3.7 y 8) que nos permiten especular sobre las funciones biológicas relacionadas con cada una de las zonas de desarrollo. De esta manera generamos cuatro grupos de genes con picos de expresión en Columela (Col); Meristema Apical (L1-L3) donde L1 corresponde al CQ y el SCN, y L2-L3 a las células en activa proliferación; Zona de Transición y Zona de Elongación (L4- L8) donde las células gradualmente dejan de proliferar para comenzar a elongarse; y por último la Zona de Maduración (L9-L12) donde las células adquieren su identidad y tamaño final (Figura R3.7 y 8).

En el caso de los genes regulados negativamente, puede verse en primer lugar, que aparece un grupo de genes reprimidos porAN3en la columela (Col) (53 genes de un total de 327), que no fueron detectado para el caso de los genes regulados por GRF3 (Figura R3.7). Una inspección detallada mostró que la proteínaAN3puede ser detectada en las SC de columela (Figura R2.5E), de modo que se podría pensar que la regulación de la expresión de genes en la Col se da en este grupo de células dondeAN3se expresa.

En segundo lugar, aparece el grupo de genes que presentan un pico de expresión en el meristema apical, en donde se encuentra el 50% de genes co-reprimidos porAN3yGRF3. Como era de esperar en este grupo se incluyen PLT1, PLT2, GLV3, GLV6 y GLV9, es decir los genes que se expresan específicamente en el SCN y que son reprimidos por el complejo GRF/GIF en las células en activa proliferación.

Por último, resulta interesante destacar que el solapamiento entre ambos sistemas en los grupos de genes correspondientes a zona de transición y zona de elongación como así también de la Zona de Maduración es mucho menor indicando que en estas zonas AN3 y GRF3 pueden estar cumpliendo funciones independientes.

Figura R3.7. Patrón de expresión a lo largo del eje longitudinal de la raíz de los genes regulados negativamente por AN3 o GRF3. (A) Raíz de Col-0 mostrando las diferentes zonas de desarrollo. Las líneas horizontales marcan las secciones ("Layers"L1 a L12) definidas según el Root Gene Expression Atlas (104).(B)y(C)Perfiles de expresión (z-score) de genes (eje X) reprimidos en los sistemas induciblesAN3-GR-GFP(B)yrGRF3-GR-GFP(C)según la base de datos de Root Map (104).

La distribución de genes regulados en diferentes grupos, de acuerdo a su patrón de expresión, permitió encontrar dentro de los genes regulados exclusivamente por AN3 un enriquecimiento de categorías de Ontología Génica relacionadas con la síntesis y la organización de la pared celular (Figura R3.7; Tabla R3.3) en la Zona de Transición y Zona de Elongación. Sobre la base de estos resultados, una inspección más detallada de la mutantean3al nivel de la zona de elongación indicó que la misma era de mayor longitud en comparación con la planta silvestre (datos no mostrados),

resultado que junto con el aumento del largo de células de la corteza en la zona madura (Figura R2.2C) justifica el incremento en la velocidad de crecimiento de la raíz primaria de esta mutante. El aumento de la expresión de genes relacionados con la síntesis de pared celular podría dar cuenta del aumento en el tamaño de las células en estas zonas en la raíz dean3.

Descriptor Descripción p-value GO:0042545 cell wall modification 5.50E-06 GO:0071555 cell wall organization 1.20E-05 GO:0071554 cell wall organization or biogenesis 0.00027 GO:0008152 metabolic process 0.00051 GO:0016051 carbohydrate biosynthetic process 0.00054 GO:0005975 carbohydrate metabolic process 0.00043 GO:0044262 cellular carbohydrate metabolic process 0.00095 GO:0044042 glucan metabolic process 0.001 GO:0000902 cell morphogenesis 0.0013 GO:0046527 glucosyltransferase activity 6.00E-06

GO:0003824 catalytic activity 6.00E-06

GO:0016758 transferase activity, transferring hexosyl groups 7.20E-05 GO:0016757 transferase activity, transferring glycosyl groups 0.00063

Tabla R3.3 Categorías de ontología génica enriquecidas en la lista de genes reprimidos sólo por AN3 que se expresan en la Zona de Transición y de Elongación.

Los genes regulados positivamente por los sistemas AN3 y GRF3 presentaron un patrón de expresión a lo largo del eje longitudinal de la raíz muy similar. AN3 y GRF3 co-regulan aproximadamente la misma cantidad de genes en cada una de los grupos descriptos. Particularmente se encontró a GRF3 activando la expresión de genes que se expresan en la Columela, resultado que podría explicarse en base a la expansión de la expresión de rGRF3 hacia el SCN debido a la incapacidad de ser regulado post-transcripcionalmente por el miR396.AN3reprime y activa genes en esta sección, lo cual puede verse relacionado con el hecho de que la columela incluye tanto células que proliferan como así también células diferenciadas.

Figura R3.8. Patrón de expresión a lo largo del eje longitudinal de la raíz de los genes inducidos por AN3 o GRF3. (A)Raíz de Col-0 mostrando las diferentes zonas de desarrollo. Las líneas horizontales marcan las secciones ("Layers" L1 a L12) definidas según el Root Gene Expression Atlas (104).(B)y(C)Perfiles de expresión (z-score) de genes (eje X) inducidos en los sistemas induciblesAN3-GR-GFP(B)yrGRF3-GR-GFP(C)según la base de datos de Root Map (104).