La suspensión de ovocitos obtenida posterior al proceso de desprendimiento (apartado 3.1.6.) se extiende en portaobjetos y se fija para su posterior análisis citogenético. A continuación se describe la metodología que se utiliza para la realización de la extensión y fijación de ovocitos tanto cultivados (T7, T14 Y T21) como para ovocitos en T0.
• Se resuspende el botón celular obtenido del proceso de desprendimiento del cultivo (apartado 3.1.7) en 1ml de solución PBS.
• Se pipetea dentro del complejo de cito-centrifugación (portaobjetos montado en el soporte de la cámara de citocentrifugación) 0.5ml de solución de sacarosa 0.02M. • Se pipetea 20μl de la suspensión celular.
51 • Se centrifuga 15minutos a 115g.
• Se retira el portaobjetos del complejo de cito-centrifugación y se coloca en una cámara húmeda durante dos horas.
• Se pipetean 0.6ml de la solución de fijación transcurridas 2 horas (formaldehído en solución acuosa al 9%, pH=10.0).
• Se deja fijar la muestra dentro de una cámara durante 24 horas a temperatura ambiente.
• Se lavan los portaobjetos con una solución de 1% PhotoFlo (Kodak). Se realizan 4 lavados de 1 minuto cada uno de ellos.
• Se secan los portaobjetos a temperatura ambiente y posteriormente se realiza el proceso de inmunotinción. Los portaobjetos en los que no se realiza la inmunotinción de manera inmediata, se almacenan a una temperatura de -80°C.
Reactivos y equipos
•
Pipetas Pasteur•
Filtros de 22μm (Millipore)•
Tubos cónicos de centrífuga•
Bisturí•
Pinzas de disección•
PBS (Sigma)•
Recipiente estéril de 50 ml•
Vidrio de reloj•
Formaldehído (Fluka)•
PhotoFlo (Kodak)•
Microscopio estereoscópico (Wild Heerbrugg)•
Citocentrífuga (Janetzki)•
Agujas entomológicas•
Criotubos (Nunc) 3.1.10. INMUNOTINCIÓN.La inmunotinción se realiza haciendo algunas modificaciones a los protocolos descritos por Scherthan et al. (2000) y Roig et al. (2006). Los anticuerpos que se utilizan para la inmunotinción son anticuerpos monoclonales y policlonales de distintas casas comerciales, estos anticuerpos interactúan con las siguientes proteínas humanas: REC8 (sintetizada en conejo y donada por el Dr. Barbero), SYCP3 (sintetizado en conejo) (Abcam), SYCP1 (sintetizado en conejo y/o ratón) (Abcam)
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y anticuerpo monoclonal dirigido a MLH1 (sintetizado en ratón) (BD Pharmigen). La metodología aplicada en el proceso se describe a continuación:
• Las extensiones de ovocitos que se han obtenido de los cultivos (apartado 3.1.8) se lavan en agitación con 75ml de agua tridestilada y desionizada (MilliQ) durante 10 minutos a temperatura ambiente.
• Se retira el agua por decantación y se agrega 75ml solución de bloqueo a temperatura ambiente. La solución de bloqueo se prepara con: 75ml de buffer PBS, 25μl de Tween 20 (Sigma) y 0.20mg de albumina (Sigma).
• Los portaobjetos se lavan en agitación con la solución de bloqueo. Este paso se repite en 3 ocasiones, cada lavado tiene una duración de 10 minutos.
• Se coloca sobre los portaobjetos la solución con el anticuerpo primario. La solución con el anticuerpo primario está formada por 100μl de solución de bloqueo y el anticuerpo primario. Los volúmenes de anticuerpo primario que se utilizan son los siguientes: 0.5μl de anticuerpo REC8, 0.5μl de anticuerpo SYCP3, 0.5μl de anticuerpo SYCP1 y 1.5μl de anticuerpo MLH1.
• Se incuban los portaobjetos con los anticuerpos primarios durante toda la noche a 4°C. • Posteriormente a la incubación, se lavan los portaobjetos durante 15 minutos con la
solución de bloqueo. Este paso se repite en 4 ocasiones. • Se retira la solución de bloqueo mediante decantación.
• La detección de los anticuerpos primarios se hace aplicando un anticuerpo secundario conjugado con un fluorocromo. Los anticuerpos secundarios que se aplican se encuentran en una solución conformada por: 100μl de solución de bloqueo, 0.5μl de anticuerpo anti-ratón conjugado a Cy3, 0.5μl de anticuerpo anti-ratón conjugado a FITC, 0.5μl de anticuerpo anti-conejo conjugado a Cy5 y 0.5μl de anticuerpo anti- conejo conjugado a Cy3 (todos ellos de Jackson Inmunoreseach). La combinación de anticuerpos secundarios se elige de acuerdo al origen de los anticuerpos primarios. • Se incuba con la solución que incluye los anticuerpos secundarios durante una hora a
una temperatura de 37°C.
• Posteriormente a la incubación con la solución que contiene los anticuerpos secundarios, se realizan 4 lavados con solución de bloqueo. Cada uno de los lavados tiene una duración de 15 minutos y se realizan en agitación.
• Se fija la señal del anticuerpo con una incubación de 10 minutos en una solución de 1% de formaldehído.
• Se lava el portaobjetos en agitación con la solución de bloqueo durante 10 minutos. • Se aplica 25μl de DAPI (Invitrogen).
53 Reactivos y equipo • Tween 20 (Sigma)
•
Glicina (Sigma)•
Formaldehído (Merck)•
PBS (Sigma)•
0.2% BSA (Sigma)•
0.05% Tween 20 (Sigma)•
Anticuerpos primarios: Anti-REC8 de conejo (1/100) (Anticuerpo cedido por el Dr. J.L. Babero, DIO/CNB, España), Anti-SYCP3 de conejo (1/100) (Abcam), Anti-SYCP1 de conejo (1/100) (Abcam) y Anti-MLH1 de ratón (1/50) (BD Pharmigen).•
Anticuerpos secundarios (todos son de Jackson ImmunoResearch Laboratories) Anti- conejo FITC de cabra (1/100), Anti-conejo Cy3 de cabra (1/100), Anti-ratón FITC de cabra (1/100), Anti-ratón Cy3 de cabra (1/100) y Anti-ratón Cy5 de cabra (1/100).•
DAPI (Sigma)•
Vectashield (Vector)•
Cubreobjetos (Menzel-glaser)•
Parafilm (Pechiney)•
Tubos Eppendorf•
Cubetas•
Puntas de micropipetas (Eppendorf)•
Micropipetas (Eppendorf)•
Centrífuga (Janetzki)•
Agitador•
Estufa (Sharlab)•
Refrigerador•
Microscopio de fluorescencia Olympus BX (Olympus Optical Co.)•
Software Smart Capture (Vysis)3.1.11. MICROSCOPÍA.
Las preparaciones se evalúan usando un microscopio de epifluorescencia marca Zeiss modelo Axioskop y las imágenes se capturan con cámaras acopladas a detección de fluorescencia y se analizan con un sistema de análisis de imagen de epifluorescencia Photonics. Los estadios celulares se clasifican de acuerdo a lo descrito previamente en la literatura (Roig et al., 2005; Ghafari et al., 2008). En este sentido, en la figura 1.1 se muestran los estadios de la profase I estudiados mediante microscopia de epifluorescencia. De este modo, durante el leptoteno los
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cromosomas comienzan su condensación e individualización y los elementos axiales (SYCP2 y SYCP3) se ensamblan sobre la estructura proteica de REC8 que previamente une a las cromátides hermanas. Durante el zigoteno los homólogos inician su apareamiento y se unen mediante el elemento central del complejo sinaptonémico (SYCP1). Finalmente, durante el paquiteno el apareamiento y sinapsis se completa, también durante este estadio se evalúa la recombinación mediante la observación de puntos de MLH1 (MLH1 foci). Los ovocitos degenerados se identifican por la contractura y deformación del núcleo en presencia de la proteína SYCP1.
Figura 1.1. Clasificación de ovocitos de acuerdo a sus características observadas en microscopia acoplada a epifluorescencia.
Ovocitos estudiados mediante inmunofluorescencia y estudiados con microscopia de epifluorescencia. Los anticuerpos utilizados son SYCP1 en verde, REC8 en rojo, y en azul DAPI. a) Preleptoteno, b) Leptoteno, c) Zigoteno temprano, d) Zigoteno, e) Paquiteno y f) Ovocito degenerado.