Implications - A Requirements Measurement Program for Systems Engineering Projects: Metrics, In

Con el objetivo de evaluar el tipo de disgregación más apto para el cultivo de ovocitos fetales humanos, en este trabajo de tesis se han analizado cuatro diferentes métodos de disgregación. Los métodos se dividen en: métodos enzimáticos (colagenasa IV + hialuronidasa V y Tripsina) y métodos mecánicos (punción y fragmentos ováricos). Las metodologías que se aplican en cada uno de ellas se describen a continuación.

Métodos enzimáticos

Método de Colagenasa IV + Hialuronidasa V

• Se toman 2 trozos de ovario (ver apartado 3.1.3., pasos que se realizan en el laboratorio) y se cortan mecánicamente mediante la utilización de un tissue chopper en fragmentos de 1mm x 1mm x 1mm aproximadamente.

• Los fragmentos se colocan en 5ml de solución de hialuronidasa tipo V (0.01%) y colagenasa IV (0.1%) (ambos de Sigma Aldrich). Se incuba la solución con los fragmentos durante una hora a una temperatura de 37°C.

• Al terminar el período de incubación, se bloquea la actividad enzimática agregando 15ml de medio de cultivo D-MEM (Gibco). El medio de cultivo se calienta previamente a una temperatura de 37°C.

• La suspensión se centrifuga durante 10 minutos a 600g. • Se retira el medio de cultivo por decantación.

• El botón celular (pellet) se resuspende en 1.5ml de medio de cultivo y se pipetea 0.5ml de la suspensión en 3 diferentes cajas de Petri, correspondientes a los tiempos de estudio. Se les agrega 0.5ml de medio para completar 1ml por caja.

Método de Tripsina

• Se coloca el tejido en 5ml de tripsina (0.25%) (Sigma Aldrich) y se pone en agitación durante 30 minutos a una temperatura de 37°C.

• Al terminar el período de incubación, se bloquea la reacción enzimática, agregando 15ml de medio de cultivo D-MEM (Gibco) previamente calentado a 37°C.

• La suspensión se centrifuga durante 10 minutos a 600g. • Se retira el medio de cultivo por decantación.

• El botón celular se resuspende en 1.5ml de medio de cultivo y se coloca 0.5ml de la suspensión en 3 diferentes cajas de Petri, correspondientes a los tiempos de estudio. Se les agrega 0.5ml de medio para completar 1ml por caja.

Métodos mecánicos Método por Punción

• Los trozos ováricos se puncionan con aguja entomológica mediante el uso de un microscopio estereoscópico (Wild Heerbrugg). Se agregan 100μl de solución PBS y se retira la solución con el producto de la punción y se coloca en un tubo cónico estéril. Estos procedimientos se repiten 4 veces.

• Los restos de los fragmentos ováricos se trituran con el bisturí hasta obtener un material homogéneo el cual se agrega al tubo cónico.

• La solución se centrifuga a 600g durante 10 minutos.

• Se resuspende la botón celular en 1.5ml de medio de cultivo y se pipetea 0.5ml de la suspensión en 3 diferentes cajas de Petri, correspondientes a los tiempos de estudio. Se les agrega 0.5ml de medio para completar 1ml por caja.

Método de Fragmentos ováricos

• Se toman 2 trozos de ovario (ver apartado 3.1.3., pasos que se realizan en el laboratorio) y se cortan mecánicamente mediante la utilización de un tissue chopper, en fragmentos de 1mm x 1mm x 1mm aproximadamente.

• Los fragmentos se resuspenden en 0.5ml de medio de cultivo y se colocan 5 fragmentos de ovario en cada tubo cónico estéril de 10ml.

• Se agregan 4.5ml de medio de cultivo, de este modo al colocar el tubo a 30° se mantienen los fragmentos de tejido cubiertos el medio de cultivo.

Material y equipo

• Tripsina (Sigma) • Colagenasa IV (Sigma) • Hialuronidasa V(Sigma)

• Medio de Cultivo D-MEM (Gibco) • PBS (Sigma)

• Tubos cónicos 10ml (Nunc) • Cajas de Petri (Nunc) • Vidrio de Reloj • Bisturí

• Hojas de bisturí • Pinzas de disección

• Microscopio estereoscópico (Wild Heerbrugg) • Baño de agitación termo-regulable

• Estufa de incubación • Centrífuga (Sharlab) 3.1.5. MÉTODOS DE SIEMBRA.

La siembra de los ovocitos que se disgregan siguiendo los métodos indicados en el apartado 3.1.3., se realiza de dos maneras diferentes. Los ovocitos que se obtienen de los métodos de disgregación enzimáticos así como los que se obtienen mediante punción se siembran en cajas de Petri de 2,5cm2 _{de superficie. Los ovocitos que se obtienen mediante el método de}

disgregación de fragmentos ováricos se siembran en suspensión mediante la utilización de tubos cónicos de 10ml. A continuación se describe la metodología empleada para cada una de las dos opciones posibles.

Cultivo en caja de Petri de 2,5cm2

• Se resuspenden los ovocitos y se colocan en una caja de Petri de 2,5cm2_{de diámetro,}

estériles y tratada previamente con poli-D-lisina, 0.1mg/ml (Sigma Aldrich) y se coloca en incubadora a una temperatura de 37°C y una atmosfera de 5% de CO2.

• Se realiza cambio de medio de cultivo cada tercer día después de la siembra. Este proceso de cambio de medio es parcial, es decir de los 1.5ml de medio que se colocan inicialmente se extrae 1ml y se remplaza con 1ml medio de cultivo fresco.

• El cultivo se monitoriza de manera diaria para evaluar su evolución y vigilar sus condiciones de esterilidad.

• Para cada una de las muestras, se realiza un cultivo por triplicado. Cultivo en suspensión

• Se resuspende el botón celular (pellet) en medio de cultivo previamente calentado a una temperatura de 37°C y se coloca en un tubo cónico de 10ml estéril, posteriormente se lleva a incubadora a una temperatura de 37°C y una atmosfera de 5% de CO2.

• Se monitoriza el cultivo de manera diaria para evaluar su evolución y vigilar sus condiciones de esterilidad.

• Para cada una de las muestras, se realiza un cultivo por triplicado. Material y equipo

• Cajas de Petri de 2,5cm2_(Nunc)

• Tubos cónicos 10ml (Nunc)

• Agua tridestilada desionizada (MiliQ) • Medio de cultivo D-MEM (Gibco) • Poli-D-lisina (Sigma Aldrich) • Puntas de micropipetas (Finntip) • Micropipetas (Eppendorf) • Incubadora

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