El desarrollo de la biología molecular y la producción de anticuerpos monoclonales, ha permitido disponer, en los últimos años, de reactivos de diagnóstico de gran sensibilidad y especificidad, incluso en forma de KITS, de fácil y sencilla realización e interpretación. De entre todos los métodos actualmente disponibles, destacaremos en este capítulo, por una parte, aquellos que presentan las mayores posibilidades para llevar a cabo estudios serológicos a gran escala y pueden ser realizados sin necesidad de grandes medios técnicos.
Sensibilidad de las diferentes técnicas para la detección de anticuerpos ( g/ml) MÉTODO SENSIBILIDAD ( g/ml) Precipitación en gel 30 Precipitación en anillo 18 Aglutinación bacteriana 0,05 Fijación de complemento 0,05 Hemaglutinación pasiva 0,01 Inhibición de la hemaglutinación 0,005 Inmunofluorescencia 0,005 ELISA 0,0005 Neutralización bacteriana 0,00005 PRUEBAS SEROLOGICAS
Basada en la capacidad que tiene el organismo humano de responder frente a una agresión microbiana formando anticuerpos específicos (IgG, IgM) contra los antígenos microbianos, situación que puede ser detectada y servir de ayuda diagnóstica.
Por otro lado, es factible detectar la presencia de antígenos en los fluidos biológicos para todos estos casos se han diseñado una variedad de puebas.
Entre las pruebas serológicas más comunes tenemos: Aglutinación, precipitación, inmunofluorescencia, turbidimetría, Inmunoensayo (RIA, EIA, EQL, WB).
a). Aglutinación. Tipos:
Directa
Indirecta (pasiva): Antígeno Aglutinación Reversa: Anticuerpo Inhibición de la Hemaglutinación b). Precipitación.
Tipos:
Precipitación en fase líquida.
Precipitación en fase sólida (inmunodifusión). Inmunofisión simple
Inmunodifusión doble Microfloculación c). Inmunofluorescencia. Tipos:
Inmunofluorescencia Directa: Anticuerpo marcado + antígeno
Inmunofluorescencia Indirecta: Anti-anticuerpo marcado + (anticuerpo + antígeno) d).- Enzimoinmunoanálisis (EIA).
Tipos:
ELISA Directa.- Para la Detección de antígenos ELISA Indirecta.- Para la detección de anticuerpos
ELISA de competición.- Para la detección de anticuerpos
e).- Western Blotting. (inmunoelectrotransferencia o westerblot) III. Ejemplos de reacciones serológicas.
A.1.- Reacciones de aglutinación para enfermedades febriles. Reacción de Widal.
Es una reacción serológica que se emplea para el diagnóstico de las infecciones líticas y paralíticas A y B. Como las salmonellas infectantes tienen ambos antígenos (O y H) es necesario determinar en el suero del paciente el nivel de los anticuerpos correspondientes a cada uno de ellos, para certificar la existencia de la enfermedad y evaluar su curso.
Reacción de Huddleson.
Se emplea para el diagnóstico de la brucelosis; se detectan los anticuerpos producidos por cualquiera de las tres especies de Brucella (B. abortus, B. suis y B. melitensis).
Reacción de Weil-Felix. Se emplea para la detección de las enfermedades por richettsia (Tifus exantemático). En este caso el antígeno no es la misma rickettsia infectante, sino la cepa de Proteus OX19, ya que ambas tienen algunas fraciones antigénicas comunes.
Existen 6 tipos de antígenos: 1.- Antígeno típico H (Flagelar) 2.- Antígeno típico O (Somático) 3.- Antígeno paratípico A
4.- Antígeno paratípico B 5.- Antígeno Brucella 6.- Antígeno Proteus OX19 Procedimiento
a. Prueba cualitativa
- Se utiliza una lámina excavada o una lámina de vidrio cuadrado de 15cm de lado dividida en 36 cuadrados pequeños.
- Se pone las siguientes marcas, en la parte superior: O, H, A, B, Br. OX que corresponden a cada uno de los antígenos enumerados anteriormente.
- Se coloca una gota del suero del paciente en cada uno de los 6 cuadrados.
- Se coloca una gota de antígeno sobre la del suero en el cuadrado respectivo y se mezclan. - Después de un reposo de 1 a 3 minutos se observa el resultado:
1. POSITIVO Cuando hay aglutinación visible a simple vista. 2. NEGATIVO cuando las mezclas permanecen homogéneas. b.- Prueba cuantitativa
En 5 cuadrados diferentes se colocan cantidades decrecientes de suero problema, utilizando una pipeta de 0.2 cc. Luego se agrega una gota de antígeno, se mezcla y se lee. En la gráfica puede verse la cantidad de suero usada y el título que le corresponde.
Tubo N° Suero Problema (ml) Antígeno Título 1 2 3 4 5 0.08 0.04 0.02 0.01 0.005
01
Gota01
Gota01
Gota 01 Gota 01 Gota 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320Cuando la aglutinación persiste hasta el título de 1/320 se hacen diluciones al décimo del severo problema (0.1 cc de suero y 0.9 cc de solución salina). Se procede igual como indica el cuadro y el resultado se multiplica por 10.
VALORES NORMALES
Reacciones Antígeno – Anticuerpo
Anti –Típhico H Valor diagnóstico 1:128 Anti –Típhico O Valor diagnóstico 1:160 Anti –Típhico A Valor diagnóstico 1:80
Anti –Típhico B Valor diagnóstico 1:80 Brucellas Valor diagnóstico 1:80 Proteus OX19 Valor diagnóstico 1:80 B.- REACCIONES SEROLOGICAS EN LA CLINICA
Prueba de VDRL: Venereal Disease Research Laboratory
Se llama así a la reacción de floculacion adaptada por la Venereal Disease Research Laboratory de Estados Unidos en la que se utiliza antígeno la cardiolipina, con la cual se efectúan pruebas para un diagnóstico presuntivo de sífilis.
Reactivos
- Antígeno VDRL
- Diluyente de solución salina tamponada Técnica
1.- Prueba cualitativa
a. Preparación del suero
- El suero se obtiene a partir de sangre coagulada y posteriormente centrifugada.
- Llevar el suero claro al baño de agua a 56° C por 30 minutos con el objeto de inactivar el complemento.
b. Preparación del antígeno
- Pipetear 0.4 mL. de la solución salina tamponada en el fondo del frasquito pequeño. - Añadir 0.5 mL de antígeno girando el frasquito continuamente sobre una superficie
plana.
- Añadir 4.5 mL. de solución salina tamponada, luego agitar de arriba – abajo repetidas veces.
c. Prueba
- Agregar una gota de suspensión de antígeno - Llevar al agitador por el espacio de 5 minutos.
d. Resultados
- Grumos medios y grandes REACTOR ( R) - Grumos pequeños DEBIL REACTOR (DR)
- Sin grumos o aspereza ligera NO REACTOR (NR) 2.- Prueba cuantitativa
Todos los sueros que resulten Reactor y Débil reactor en la reacción cualitativa debe analizarse cuantitativamente.
1.- Prepara diluciones del suero problema a: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, de la siguiente manera.
- A cada tubo número de 6 colocar 0.5 cc de suero fisiológico.
- Agregar 0.5 cc del suero del paciente al primer tubo y mezclar bien.
- Transferir de primer tubo al segundo y previa mezcla transferir 0.5 cc el segundo al tercero y así sucesivamente hasta el sexto tubo. Al final se elimina los 0.5 cc sobrantes. 2.- Colocar 0.05 cc de cada dilución de una excavación de la lámina es decir de la dilución ½, tomar 0.05 cc y colocarlo en una excavación y así sucesivamente.
3.- Agregar con la ayuda de una hipodérmica con aguja N° 10 un agota de antígeno en cada dilución.
4.- Realizar movimientos de rotación a más o menos 120 RPM durante 4´.
5.- Realizar la lectura con ayuda del microscopio y observar la presencia o ausencia de floculación.
6.- Para el resultado se toma en cuenta la última dilución que presenta aglutinación. CUESTIONARIO
1. Explique el fundamento de la prueba de ELISA y sus aplicaciones. 2. Explique el fundamento de la prueba de RPR.
PRÁCTICA N° 11
I. OBJETIVOS
Conocer el fundamento, las técnicas serológicas y su aplicación en el diagnóstico de diferentes enfermedades.
Conocer el fundamento e importancia de la determinación del grupo sanguíneo
Conocer el fundamento del diagnóstico de embarazo II. INTRODUCCIÓN
DETERMINACIÓN DE GRUPO SANGUÍNEO ABO Y FACTOR RHESUS
Cuando se producen anticuerpos en respuesta a glóbulos rojos producidos por individuos de su misma especie se habla de isoanticuerpos o isoantígenos. Tal es el caso de la presencia de isoantígenos en los glóbulos rojos del hombre controlados genéticamente y transmitidos a través de los cromosomas; de acuerdo a esto se han establecido en el hombre la presencia de diferentes grupos sanguíneos. Igualmente en el suero se contratarán anticuerpos contra los ausentes.
Si colocamos glóbulos rojos frente a antisueros conocidos podemos identificar los antígenos presentes por la presencia de una reacción de aglutinación. Sin embargo no basta sólo una identificación del grupo sanguíneo tanto del donante como del receptor, es necesario enfrentar el suero del paciente con los glóbulos rojos de donante para tener la seguridad que no hubo error y excluir algunas irregularidades de la reacción que se produce a veces.
En el año de 1900 Karl Landststeiner establece el sistema AB() para la clasificación de la sangre, años después se llegó a establecer el AB, A1 (Ag. fuerte). A2 (Ag débil ). A3. ...., Am.. Posteriormente se estableció muchos grupos: ABO, MNSs, P, Rh, Lutheran, Kell, Lewis, Daffv, Kidd, Auberg, Xg, Doombrok
Grupo Sanguíneo ABO.- En los glóbulos rojos. los determinantes antigénicos, están a nivel de la membrana celular; los cuales se tratan de aminoazúcares: glucosamina y galactosamina, los que ligados a proteínas (por que son haptenos) adquieren la capacidad antigénica.
Características de los cuatro tipos sanguíneos: ABO
Grupo Sanguíneo G.R.: Antígenos Suero/Plasma: Anticuerpo "A" "B" "AB” "O" A B A y B --- Anti- A Anti- B -- Anti- A y Anti-B
Factor Rhesus.- En el Año de 1940 Landsteiner - Wiener descubrieron el Factor Rh, cuando estudiaban la sangre de los monos Macaccus rhesus, el cual también presentaba el 85% de la población humana. El estudio del factor Rh es muy importante para las transfusiones sanguíneas,