La generación de variantes virales resistentes a agentes antivirales está dificultando el control de un gran número de enfermedades importantes ocasionadas por los picornavirus y otros virus RNA. Las mutaciones en 3D que permiten la viabilidad del virus en presencia de R proporcionan un modelo para estudiar la dinámica de generación de mutantes resistentes a agentes mutagénicos y su comportamiento evolutivo. En este sentido, un mecanismo podría ser la adquisición de mutaciones que confieran mayor fidelidad de copia a la polimerasa, limitando la incorporación de cualquier nucleótido incorrecto, tal y como se ha descrito para el mutante G64S de poliovirus (PV) (Arnold et al., 2005, Pfeiffer & Kirkegaard, 2003, Vignuzzi et al., 2006). Otra posibilidad sería que la mutación confiriera una menor capacidad de emplear RTP específicamente como sustrato. Este parece ser el mecanismo asociado a la mutación M296I de VFA descrita en nuestro laboratorio (Sierra et al., 2007), ya que los datos tanto de cultivos celulares, como in vitro, no mostraron una mayor fidelidad de copia de este mutante, sino una menor frecuencia de incorporación de RMP respecto al nucleótido correcto que 3D wt (Arias et al., 2008, Sierra et al., 2007).
El análisis estructural del complejo de la polimerasa de VFA con un RNA molde- iniciador y los sustratos naturales (ATP/UTP) o con RTP (Ferrer-Orta et al., 2007) ha permitido proponer un posible efecto de la mutación M296I en la sensibilidad a R del VFA tal y como se detalla en (Sierra, 2007). El aminoácido M296 se encuentra situado en el bucle flexible β9-α11
del dominio fingers de la polimerasa (Figura 6.2), que interacciona con el nucleótido entrante y podría participar en la discriminación de nucleótidos correctos e incorrectos (Ferrer-Orta et al., 2004, Ferrer-Orta et al., 2007). La sustitución M296I podría afectar la conformación y flexibilidad del bucle, alterando las interacciones con el NTP entrante o con la base aceptora del molde. Se han descrito mutaciones, tanto en DNA polimerasas como en la RT de HIV, bien cercanas o alejadas del centro activo de la polimerasa, que pueden tener efectos en la fidelidad del enzima como resultado de cambios dinámicos y/o estáticos en el tamaño y flexibilidad del centro activo (Harris et al., 1998, Kim et al., 1999, Kim et al., 2006, Osheroff et al., 1999). En la actualidad, el grupo de la Dra. Nuria Verdaguer está realizando la co-cristalización de las polimerasas mutantes estudiadas en esta Tesis Doctoral en complejo con un molde RNA con GTP, ATP y/o RTP para proponer un mecanismo más preciso de la participación de las mutaciones P44S, P169S y M296I en la discriminación de RTP.
El residuo P169 mapea en el motivo F del subdomino fingers conservado en las RdRps (apartado 2.6.1 de Introducción). Se encuentra flanqueado por los aminoácidos básicos R168 y K172 encargados de la coordinación del grupo trifosfato del nucleótido entrante, y está cercano al motivo conservado KDE de unión a RNA (Ferrer-Orta et al., 2006b, Ferrer-Orta et al., 2004). P169 no está conservado en picornavirus y corresponde a la posición S164 en PV. Por su situación, parece un candidato ideal para ser un determinante de fidelidad en 3D. En la presente Tesis Doctoral se muestra que las polimerasas con el cambio P169S muestran una menor capacidad de incorporar RMP frente a C y U en el molde. Además, el espectro de mutantes derivado de pMT28-3D(3M) tiene un número menor de mutaciones que el de pMT28 tanto en ausencia como en presencia de 5000 µM R (apartado 5.1.12 de Resultados).
Figura 6.2 Esquema de los aminoácidos que contactan directamente con M296. a) Se representan M296 (en gris)
y los aminoácidos que contactan con este residuo (en blanco). Se muestran el RNA molde (rojo) y el RNA cebador (azul) como referencia. M296 se encuentra en contacto con N307 y el aspártico catalítico D245 (en negro),que juegan un papel fundamental en el reconocimiento del nucleótido ya que sus cadenas laterales establecen puentes de hidrógeno con el grupo 2´ OH de la ribosa (Ferrer-Orta et al., 2006b, Ferrer-Orta et al., 2007). M296 también está próximo a los residuos C300 y T303 , que establecen contactos con la base del NTP y con los residuos conservados
S298 y G299, los que, a su vez, contactan con la base del NTP y RTP (Ferrer-Orta et al., 2007). Se indica la distancia en Å entre el residuo 296 y el 307. b) Igual que a) modelando en la posición 296 un residuo de isoleucina. Las figuras se han realizado empleando el programa pymol (DeLano Scientific LLC). Las coordenadas cristalográficas empleadas han sido obtenidas de la base de datos de estructura de proteínas (PDB; http://www.pdb.org; código 1WNE).
6.6.1 La sustitución P44S en 3D favorece la aparición de transiciones U→C y A→G
En las competiciones realizadas con pMT28-3D(P44S), la mutación P44S en 3D no otorga ninguna ventaja o desventaja del virus en presencia o ausencia de R (apartado 5.1.9 de Resultados). De acuerdo con los datos presentados en esta Tesis Doctoral, la polimerasa de VFA durante el tratamiento con R evoluciona para adquirir el cambio P44S que tiene una preferencia por incorporar RMP frente a U en lugar de frente a C, lo que conduciría a la reducción de las transiciones C→U y G→A durante el tratamiento con R. Esta reducción se confirma en los espectros de mutantes de las poblaciones de VFA pasadas en presencia de R que contienen la polimerasa 3D(3M) (apartado 5.1.12.1 de Resultados). Estas poblaciones tienen una mayoría de transiciones de tipo U→C y A→G, mientras que en poblaciones wt tratadas con R, las transiciones mayoritarias son de tipo C→U y G→A (Sierra et al., 2007). El mantenimiento de un determinado patrón de transiciones está relacionado con la composición de nucleótidos del genoma y con el mantenimiento de la información genética. Existen varias causas que justifican patrones asimétricos durante la aparición de transiciones: preferencia por el uso de determinados codones, mantenimiento de estructuras secundarias de RNA, conservación de secuencias de RNA con función propia, etc. (Frank & Lobry, 1999, Galtier & Lobry, 1997, Hurst & Merchant, 2001, Wang & Hickey, 2002). Dado que la conservación de estructuras secundarias en el RNA de VFA es necesaria para la funcionalidad del genoma, la tendencia a que aumenten las transiciones U→C y A→G en presencia de R para contrarrestar el aumento de transiciones C→U y G→A puede ser favorable para compensar posibles mutaciones deletéreas. Así, una polimerasa mutante con una predilección para incorporar RMP frente a U en lugar de frente a C, mitigará los efectos producidos por el incremento de las transiciones C→U y G→A y conferirá una ventaja a VFA.
Experimentos bioquímicos preliminares parecen indicar que el incremento de transiciones U→C y A→G producido por la polimerasa 3D(3M), no es exclusivo para el apareamiento incorrecto de RMP frente a U. Esta enzima incorporaría incorrectamente ~2 veces más GMP frente a U, que UMP frente a G, lo que favorecería, de acuerdo con los resultados mostrados en esta Tesis Doctoral, un incremento de las transiciones U→C y A→G en el espectro de mutantes de pMT28-3D(3M) tanto en presencia, como en ausencia de R (apartado 5.1.12.1).
Existen varios casos documentados de mutantes de polimerasas que promueven específicamente la aparición de ciertos tipos de mutaciones durante la replicación. La sustitución R283K en la polimerasa pol β provoca un incremento de 10 veces en incorporación incorrecta de dCMP frente a T o A en el molde, con respecto a la polimerasa wt; sin embargo, ambas muestran la misma fidelidad en incorporar dGMP frente a T o A en el molde (Osheroff et al., 1999). El mutante de infidelidad E710A de la DNA polimerasa I de E. coli muestra
preferentemente incorporación incorrecta de pirimidinas (Minnick et al., 1999). Sorprendentemente, el mutante de fidelidad incrementada R72A de la retrotranscriptasa de VIH- 1, presenta incorporación incorrecta de GMP frente a T, en un determinado contexto de secuencia, hasta 170 veces mayor que la observada con la proteína wt (Lewis et al., 1999).
Los datos mostrados en la Figura 5.16 (apartado 5.2.4.2 de Resultados) también indican un defecto en la capacidad de las polimerasas mutantes con las sustituciones P44S y/ó P169S, tanto solas como acompañadas, de elongar RNA en presencia de RTP con respecto a 3D wt y 3D(M296I). Una menor tasa de elongación del RNA en estas condiciones puede constituir un mecanismo adicional de resistencia a R mediante el cual, estas polimerasas, dispondrían de un mayor tiempo para chequear los contactos adecuados que se forman entre 3D, NTP entrante y RNA naciente, durante la síntesis del RNA viral.
La posibilidad de elongar un RNA en el que ha sido incorporado previamente RMP, permite explicar la viabilidad del virus pMT28-3D(P44S) en presencia de R (apartado 5.1.9 de Resultados), cuya polimerasa puede incorporar R frente a C en el molde, en presencia del nucleótido que se incorpora correctamente en la posición siguiente (comparar Figuras 5.15 y
5.16 de Resultados).
La posición P44 se encuentra conservada entre las polimerasas de otros picornavirus y mapea en el subdominio fingertips de 3D (Ferrer-Orta et al., 2004), alejada del centro activo de la enzima. Sin embargo, está cerca del sitio de reconocimiento del nucleótido entrante. Los datos preliminares obtenidos por el grupo de la Dra. Nuria Verdaguer a partir de las estructuras con polimerasas mutantes, muestran que tal vez sea durante la captación del nucleótido entrante, más que durante su estabilización en el centro activo y su posterior incorporación al RNA naciente, donde resida la capacidad discriminatoria frente a R de la sustitución P44S (comunicación personal de Nuria Verdaguer). Se requieren estudios bioquímicos adicionales encaminados a determinar si los cambios P44S y P169S son mutantes de fidelidad, como G64S en 3D de PV, o si discriminan específicamente RTP, como ocurre con M296I en 3D de VFA.
Resulta intrigante que la polimerasa 3D(P44S) muestre tan bajos niveles de incorporación in vitro con respecto a 3D wt, mientras que el clon infeccioso correspondiente pMT28-3D(P44S) no tiene ninguna diferencia en infectividad o en fitness con respecto a pMT28 (apartados 5.1.7 y 5.1.9 de Resultados). Probablemente información sobre las frecuencias de mutación in vitro de 3D(P44S) y la medida de la frecuencia de error y el tipo de transiciones originadas en el espectro de mutantes de las poblaciones derivadas de pMT28- 3D(P44S) sea de utilidad para explicar el comportamiento de esta mutación en el contexto de 3D de VFA en cultivos celulares.