Los virus RNA replican con una tasa de error varios órdenes de magnitud superior a la observada normalmente en DNA celular y en muchos virus DNA. Este hecho, unido a sus altas tasas de replicación por unidad de tiempo y generalmente un elevado tamaño poblacional, conduce a una elevada diversidad genética que acelera la capacidad de adaptación del virus a los cambios ambientales. Como consecuencia de las altas tasas de error, las poblaciones de virus RNA son distribuciones complejas de mutantes denominadas cuasiespecies (apartado 2.1 de Introducción). La rápida evolución de los virus RNA conlleva importantes consecuencias médicas, ya que la mayor parte de las infecciones causadas por estos virus no pueden ser controladas de manera efectiva en la actualidad debido a la rápida selección de mutantes que escapan a drogas antivirales, vacunas y/o respuestas inmunes.
Existe, por tanto, la necesidad de explorar nuevas estrategias antivirales que tengan en cuenta la dinámica de cuasiespecies del patógeno diana. Una de estas estrategias, actualmente en estudio, consiste en forzar la entrada del virus en catástrofe de error mediante mutagénesis incrementada (mutagénesis letal). Se basa en aumentar artificialmente el número de errores durante la replicación viral más allá del umbral de error tolerable mediante el empleo de agentes mutagénicos (Anderson et al., 2004, Biebricher & Eigen, 2005, Biebricher & Eigen, 2006, Domingo, 2005, Drake & Holland, 1999, Eigen, 2002, Graci & Cameron, 2004) (apartado 2.2 de Introducción).
Las RNA polimerasas dependientes de RNA (RpRd) son las proteínas responsables de la replicación de los virus RNA. La baja fidelidad de copia que presentan y la ausencia de una actividad correctora de errores son responsables, al menos en parte, de la alta frecuencia de mutación durante la replicación de los genomas virales (Batschelet et al., 1976, Domingo, 2007, Drake & Holland, 1999). Las interacciones entre las RdRp, RNA y los nucleótidos sustratos (NTPs) en el centro activo de la enzima determinan la fidelidad de copia de la polimerasa durante el proceso de replicación. Estudios estructurales han definido los aminoácidos de la RdRp de VFA (3D) que interaccionan con el molde-iniciador RNA (Ferrer-Orta et al., 2004) y los que interaccionan con nucleótidos estándar y con los análogos de nucleótido mutagénicos, 5- fluorouridina-5´-trifosfato (FUTP) y ribavirina-5´-trifosfato (RTP) (Ferrer-Orta et al., 2007).
En esta Tesis Doctoral se ha estudiado la evolución de VFA sometida a incrementos en la concentración de R para profundizar en las bases moleculares de la extinción viral por mutagénesis y en los mecanismos de resistencia a la extinción por parte del virus. Este estudio ha permitido detectar la continua selección de mutantes de VFA en 3D en un proceso de adaptación a R y la existencia de otras proteínas virales como dianas de los mutágenos que también son susceptibles de adaptarse a la presencia de la droga.
6.2 La replicación con concentraciones crecientes de ribavirina
conduce a la continua adaptación del VFA a la droga
Resultados previos en nuestro laboratorio han demostrado que R ejerce su actividad antiviral durante infecciones persistentes de VFA mediante mutagénesis letal (Airaksinen et al., 2003, Arias et al., 2005). Recientemente hemos obtenido una población de VFA con menor sensibilidad a R en infecciones citolíticas que presenta la sustitución M296I en la polimerasa del virus (Sierra et al., 2007). En este estudio se observó que la población resistente presentaba una alta heterogeneidad en el espectro de mutantes de 3D, sugiriendo que otras posibles mutaciones acompañantes a M296I en la región 3D y/o en otras regiones del genoma pudieran estar apareciendo como respuesta del virus a la droga (Sierra et al., 2007). Para profundizar en las bases moleculares de la acción mutagénica de R en infecciones citolíticas y determinar si se seleccionan nuevas mutaciones asociadas a la resistencia, se ha analizado el efecto de la replicación en presencia de concentraciones crecientes de R sobre esta población resistente (apartado 5.1 de Resultados).
La población de partida R-Ap35 (VFA MARLS pasado 35 veces en presencia de concentraciones crecientes de R, hasta 800 µM R), presenta una alta heterogeneidad medida tanto por la frecuencia de mutación del espectro de mutantes como por el valor de la entropía de Shannon (Sn) de la región 3D, con respecto a una población control (apartados 5.1.3, 5.1.4 y 5.1.5 de Resultados). Tras 10 pases en presencia de la misma concentración de mutágeno, se obtiene una población (R-Ap45) cuya heterogeneidad disminuye, y tras otros 15 pases en presencia de concentraciones crecientes de R (hasta 5000 µM R), la heterogeneidad vuelve a aumentar levemente (apartados 5.1.3, 5.1.4 y 5.1.5 de Resultados). Estos resultados reflejen la continua evolución del virus en su adaptación a R, explorando diversas soluciones posibles hasta la imposición de mutaciones que le confieran menos sensibilidad a R. Nuestra interpretación es que debido a la constante presión selectiva, se produce la eliminación de aquellas variantes con mutaciones que disminuyen la viabilidad del virus en presencia de R y la fijación de mutaciones que implican mayor adaptación a esta droga (comparar las poblaciones R-Ap35 y R-Ap45 en las Tablas 5.2 y 5.5 de Resultados). Así, durante la evolución de R-Ap35 hacia R-Ap60, se mantienen mutaciones que otorgan menor sensibilidad a R (como la mutación que provoca la sustitución M296I en 3D), se acaban imponiendo completamente mutaciones en la secuencia consenso del virus (como la que codifica el cambio P44S en 3D) y se fijan otras mutaciones nuevas ante el aumento de presión selectiva (como la que codifica la sustitución P169S en la región 3D).
Los espectros de mutantes de las poblaciones R-Ap35, R-Ap45 y R-Ap60 muestran un valor de Sn igual a 1 (apartado 5.1.4 de Resultados), ya que todas las secuencias analizadas son diferentes, independientemente de la carga mutacional de cada una de ellas. Como consecuencia, el valor de Sn no resulta un buen estimador de la heterogeneidad en poblaciones altamente mutadas como las aquí estudiadas. Por esta razón, las secuencias del espectro de mutantes de cada una de estas poblaciones se han sometido a un análisis por PAQ (Partition Analysis of Quiasispecies) realizado en nuestro laboratorio por el Dr. Samuel Ojosnegros (Ojosnegros et al., 2008). Este análisis permite estudiar la estructura intrapoblacional de la
cuasiespecie mediante una comparación clon a clon. Los resultados obtenidos corroboran la idea de que la diversidad de la población se expande debido a la influencia de la R y que tras la imposición de la mutación de resistencia M296I, se reduce la diversidad poblacional hasta valores que se mantienen hasta el pase 60 (población R-Ap60). El estudio de la relación entre mutaciones sinónimas y mutaciones no sinónimas encontradas a lo largo del genoma en las poblaciones MARLS pasadas en presencia de R también indica que la presencia de la droga ha eliminado aquellas variantes menos aptas para replicar bajo la presión selectiva de R (selección purificadora) (Ojosnegros et al., 2008).