Anteriormente en nuestro laboratorio, se ha descrito que 5-fluorouracilo (FU) produce una pérdida en la infectividad viral, y en algunos casos, la extinción de VFA en cultivos celulares asociada a un aumento en la complejidad del espectro de mutantes (Pariente et al., 2003, Pariente et al., 2005, Pariente et al., 2001, Sierra et al., 2000). Experimentos adicionales han demostrado que FU inhibe la replicación viral de VFA (Pariente et al., 2003), sugiriendo que tenía un efecto tanto mutagénico como inhibitorio.
Figura 5.34 Cinética de RNA viral intracelular en presencia y ausencia de FU. Se infectan células BHK-21 a
una m.d.i. de 0,5 UFPs/célula en presencia o ausencia de 200 µg/ml FU con virus producido a partir de pMT28. Se realiza una infección independiente para cada uno de los puntos recogidos. El procedimiento para infecciones en medio líquido, extracción del RNA viral intracelular y cuantificación del mismo se describen en los apartados 4.4.1, 4.4.2, 4.5.2 y 4.9, respectivamente, de Materiales y Métodos.
Para comprobar la actividad inhibitoria de FU durante la replicación de VFA, se ha realizado una cinética de síntesis de RNA viral intracelular en presencia y ausencia de 200 µg/ml de FU (Figura 5.34). En presencia de FU, la síntesis de RNA presenta un retraso con respecto a la replicación en ausencia de la droga, confirmando que FU inhibe la replicación viral. Esta inhibición de la síntesis de RNA se traduce con una menor producción de proteínas virales (Figura 5.35).
Figura 5.35 Disminución de la síntesis de proteínas virales en infecciones en presencia de FU. Se electroporan
células BHK-21 (apartado 4.15.2 de Materiales y Métodos) con RNA transcrito a partir de pMT28 tal y como se describe en el apartado 4.14 de Materiales y Métodos, en ausencia (pMT28) o en presencia de las cantidades indicadas de GuH o de FU. Las células se marcan con [35S] Met-Cys a tiempos 2-3 h (columnas de la izquierda) o 3-4 h (columnas de la derecha) post-electroporación, tal y como se indica en el apartado 4.16 de Materiales y Métodos. “C-” electroporación en ausencia de pMT28. Debajo de cada carril se muestra el correspondiente porcentaje de proteína 3CD respecto al valor obtenido en ausencia de drogas (columna “pMT28”). Debajo de cada uno de los carriles se muestra la cantidad de actina medida por western blot (Materiales y Métodos 4.29) utilizada como control de la cantidad de extracto intrcelular utilizado.
Se observa una disminución del precursor proteico 3CD en presencia de FU a 3 h post- electroporación (49, 18 y 21% de cantidad relativa de 3CD en presencia de 200, 300 y 400 µM FU respectivamente, Figura 5.35, columnas de la izquierda). A 4 h se observa que la síntesis de proteínas virales se recupera hasta niveles normales (81%, 71% y 77% de 3CD, Figura 5.35, columnas de la derecha). Como control, se ha empleado hidrocloruro de guanidinio (GuH) que es un potente inhibidor de la replicación de VFA (Pariente et al., 2003). El GuH ejerce una actividad inhibitoria a tiempos tempranos y tardíos post-electroporación de acuerdo con resultados anteriores (Perales et al., 2007), (16 y 2% de 3CD sintetizada en presencia de 4 y 8
mM GuH, respectivamente, a las 4 h post-electroporación). Tanto FU como GuH no afectan la parada de la síntesis de proteínas celulares mediada por la proteasa L (Figura 5.35, comparar carril “C-” con el resto de carriles), sugiriendo que la reducción observada en los niveles de traducción de proteínas virales en presencia de FU, es debida a una menor replicación del virus. Estos resultados son consistentes con un efecto inhibitorio de FU en las etapas iniciales de la replicación de VFA.
Figura 5.36 Inhibición de la uriridilación de VPg por FUTP. Se realiza un ensayo de uridilación de VPg, como se
indica en el apartado 4.23.3 de Materiales y Métodos en presencia de concentraciones crecientes de dTTP, ATP, CTP, GTP, UTP, FUTP o de una mezcla equimolar de los 4 nucleótidos estándar (denominado “NTP”). a) Análisis electroforéticos representativos de ensayos de uridilación de VPg con dTTP, GTP, UTP y FUTP (concentraciones crecientes de 0-50 µM, indicado en la parte superior de la figura. “C-” indica un ensayo realizado sin enzima). b) Actividad relativa medida como porcentaje de VPg uridilada en función de la cantidad de nucleótido que se muestra
en a). Los resultados fueron obtenidos a partir de al menos 3 experimentos independientes. Se muestran las desviaciones estándar.
Figura 5.37 Efecto de la concentración de Mn2+, pH y secuencia de VPg en la reacción de uridilación y en la
inhibición por FUTP. Se han llevado a cabo experimentos de uridilación de VPg tal como se indica en el apartado
4.23.3 de Materiales y Métodos. a) Actividad de uridilacón de VPg en las concentraciones indicadas de Mn2+, relativas a la actividad con 0,6 mM Mn2+. b) Inhibición por FUTP de la actividad de uridilación de VPg relativa a diferentes concentraciones de Mn2+. c) Actividad de uridilación a diferente pH, relativa a la actividad pH 7,0. d) Inhibición por FUTP de la actividad de uridilación de VPg relativa medida a diferentes pHs. e) Uridilación relativa de las 3 isoformas de VPg de VFA (VPg-1, VPg-2 VPg-3) respecto a Vpg-1. f) Inhibición de la uridilación de las 3 isoformas de VPg por FUTP. Las secuencias de las distintas VPgs están en la Figura 4.4 de Materiales y Métodos.
Figura 5.38 Determinación de los parámetros cinéticos de la inhibición de la uridilación de VPg por FUTP. a)
Representación de Lineweaver-Burk de la uridilación de VPg por 3D en ausencia (♦) o en presencia de 1 µM (■), 5 µM (▲) y 10 µM (●) FUTP. Se muestra la media de dos conjuntos de datos. b) representación gráfica de los valores de Km,app obtenidos a partir del análisis de la gráfica descrita en a), en función de la concentración de FUTP. La pendiente de esta gráfica es Km,app/Ki,app = 7,8. A partir de este valor se determina el valor de Ki,app (1,3±0,2 μM). La reacción de uridilación de VPg y la cuantificación de los productos uridilados se realiza según se describe en el apartado 4.23.3 de Materiales y Métodos.