El hidrocloruro de guanidinio (GuH) es un potente inhibidor de la replicación de picornavirus (apartado 2.7 de Introducción). Se han descrito mutantes de resistencia a GuH en picornavirus que mapean en la región que codifica la proteína no estructural 2C en varios picornavirus (Baltera & Tershak, 1989, Belsham & Normann, 2008, Klein et al., 2000, Pariente et al., 2003, Pincus et al., 1986, Pincus & Wimmer, 1986, Tolskaya et al., 1994). La inhibición de la actividad ATPasa por GuH en ensayos in vitro ha sido documentada por el grupo del Dr. Eckard Wimmer (Pfister & Wimmer, 1999). Sin embargo, GuH no mostró tener efecto inhibitorio en experimentos posteriores realizados con 2C de otros picornavirus (De Palma et al., 2008, Klein et al., 2000). Dado que la sustitución I248T también aparece en poblaciones de VFA que adquieren resistencia a GuH (Pariente et al., 2003), resultaba interesante determinar si GuH inhibe la actividad ATPasa de 2C wt y 2C(I248T) en ensayos in vitro.
Para ello se han determinado los valores Kd,app y kpol de la actividad ATPasa de 2C y 2C(I248T) en ausencia y presencia de 10 y 20 mM GuH (Figura 5.30). En 2C wt, Kd,app se mantiene constante a concentraciones crecientes de GuH, mientras que kpol disminuye. Por tanto, se concluye de los datos que GuH ejerce una inhibición no competitiva, es decir, GuH se puede unir tanto a 2C wt como al complejo 2C-ATP en un sitio diferente del centro activo.
A partir de la recta obtenida de la representación de Kd,app/kpol en función de la concentración de GuH, se deduce que Ki,app es 10 mM (constante de disociación del inhibidor con la enzima) [Figura 5.30(b)]. Para obtener el valor de αKi,app (constante de disociación del inhibidor con el complejo 2C-ATP) se representan los valores de 1/kpol para cada concentración de GuH utilizada, en función de la concentración del inhibidor [Figura 5.30(c)]; el valor obtenido de αKi es 8 mM. Por tanto, GuH ejerce una inhibición no competitiva y muestra una afinidad similar tanto por la enzima como por el complejo enzima-sustrato. Estos valores de Ki,app y αKi,app están en el mismo rango que la concentración necesaria para inhibir la replicación de VFA en cultivos de células BHK-21 (Pariente et al., 2003).
Figura 5.30 Determinación de los parámetros cinéticos de inhibición de 2C wt por GuH. a) Representación de
los valores kobs para 2C wt en función de concentraciones crecientes de ATP en ausencia ó en presencia de 10 mM ó 20 mM GuH. Los datos experimentales se ajustan a una hipérbola en cada caso. Los procedimientos para calcular la actividad ATPasa con 2C se detallan en el apartado 4.28 de Materiales y Métodos. La representación gráfica así como la obtención de la ecuación de las distintas hipérbolas se realiza con el programa KaleidaGraph (Synergy Software). A la derecha se muestra el resultado de la cromatografía de un ensayo de actividad ATPasa en presencia de 0, 10 y 20 mM GuH. b) Representación de Kd,app/kpol de cada una de las gráficas obtenidas en a) en función de la concentración de GuH; la pendiente de la recta es (Kdapp/kpol)/Ki,app de donde se deduce que Ki,app = 10 mM. Cada una de los puntos representados se basa en al menos 3 conjuntos de datos independientes. c) Representación de la inversa de los datos de obtenidos de kpol en a) en función de la concentración de GuH, la pendiente de la recta es Kd,app/αKi,app de donde se deduce que αKi,app= 8 mM. Cada una de los puntos representados se basa en al menos 3 conjuntos de datos independientes.
El mutante 2C(I248T), por el contrario, no muestra cambios en los valores de Kd,app y kpol en función de incrementos en la concentración de GuH (10 y 20 mM) [Figura 5.31(a)]. Se ha realizado un ensayo adicional en presencia de 52 mM GuH y Kd,app y kpol tampoco se ven afectados, indicando que Ki,app y αKi,app para la inhibición de la actividad ATPasa por GuH en 2C(I248T) está por encima de 50 mM. Por tanto, no se puede deducir ningún valor de Ki,app congruente a partir de los datos de Kd,app o kpol obtenidos [Figura 5.31(a) y (b)]. Estos datos
están de acuerdo con que la mutación I248T otorga resistencia frente a la inhibición con GuH de la actividad ATPasa in vitro.
Figura 5.31 Determinación de los parámetros cinéticos de inhibición de 2C(I248T) por GuH. a) Representación
de los valores de kobs para 2C(I248T) en función de concentraciones crecientes de ATP en ausencia ó en presencia de 10 mM ó 20 mM GuH. Los datos se ajustan a una hipérbola en cada caso. Los procedimientos para calcular la actividad ATPasa con 2C(I248T) se detallan en el apartado 4.28 de Materiales y Métodos. La representación gráfica así como la obtención de la ecuación de las distintas hipérbolas se realiza con el programa KaleidaGraph (Synergy
Software). A la derecha se muestra el resultado de la cromatografía de un ensayo de actividad ATPasa en presencia
de 0, 10, 20 y 52 mM GuH. b) Representación de Kd,app/kpol de cada una de las gráficas obtenidas en a) en función de la concentración de GuH. La pendiente de la recta es (Kdapp/kpol)/Ki,app. El valor experimental de Ki,app es 296 mM. Cada una de los puntos representados se basa en al menos 3 conjuntos de datos independientes. c) Representación de la inversa de los datos obtenidos de kpol en a) en función de la concentración de GuH, la pendiente de la recta es
Kd,app/αKi,app. En este caso, el valor deαKi,app es 277 mM, muy por encima de la concentración de GuH utilizada en el ensayo. Cada una de los puntos representados se basa en al menos 3 conjuntos de datos independientes.